1-6- مقايسه جنينهاي طبيعي با جنينهاي آزمايشگاهي………………………………………………………………….26
1-7- انجماد
1-7-1- مراحل اصلي انجماد………………………………………………………………………………………………………………..30
1-7-2- راههاي کاهش اثرات زيانبار مواد محافظت کننده…………………………………………………………………..30
1-7-3- روشهاي انجماد……………………………………………………………………………………………………………………..30
1-7-3-1- انجماد شيشهاي………………………………………………………………………………………………………………….31
1-7-3-1-1- عوامل تکنيکي موثر در انجماد شيشهاي……………………………………………………………………….32
1-7-3-1-1-1- زمان تعادل و آبگيري………………………………………………………………………………………………..32
1-7-3-1-1-2- سرعت سرد کردن……………………………………………………………………………………………………..32
1-7-3-1-1-3- سرعت گرم کردن………………………………………………………………………………………………………35
1-7-3-1-1-4- مواد محافظ انجمادي…………………………………………………………………………………………………35
1-7-3-1-1-5- نقش ضد يخها……………………………………………………………………………………………………………36
1-7-3-1-1-6- ذوب و آبدهي…………………………………………………………………………………………………………….. 36
1-8- آلدوسترون…………………………………………………………………………………………………………………………………….37
1-8-1- خصوصيات……………………………………………………………………………………………………………………………….37
1-8-2- عملکرد…………………………………………………………………………………………………………………………………….38
1-9- ارزيابي کيفيت رويان……………………………………………………………………………………………………………………41
1-10- سلولهاي روياني……………………………………………………………………………………………………………………….43
فصل دوم: مروري بر متون گذشته
2-1- اثرات انجماد بر روي تخمک………………………………………………………………………………………………………..46
2-2- اثر روش انجماد شيشهاي…………………………………………………………………………………………………………….47
2-3- بيان زير واحدهاي پمپ Na/K ATpase در تخمک و جنين…………………………………………………48
2-4- پمپ Na/K ATpase ……………………………………………………………………………………………………………49
2-5- آکواپورينها………………………………………………………………………………………………………………………………….51
2-6- هچ يا تفريخ………………………………………………………………………………………………………………………………….52

2-7- فعال شدن ژنوم روياني………………………………………………………………………………………………………………..55
2-8- متابوليسم رويان…………………………………………………………………………………………………………………………..56
2-9- نقش آلدوسترون در بيان پروتيين Na/K ATpase………………………………………………………………..58
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- توليد جنين هاي حاصل از لقاح خارج رحمي (IVF)
3-1-1- جمع‌آوري تخمدان‌ها از کشتارگاه و استحصال تخمک‌ها از مايع فوليکولي……………………………61
3-1-2- بلوغ آزمايشگاهي تخمک‌ها (IVM)…………………………………………………………………………62
3-1-3- لقاح داخل آزمايشگاهي (IVF)……………………………………………………………………………………………..63
3-1-3-1- آماده سازي اووسيتهاي بالغ شده براي لقاح…………………………………………………………………….63
3-1-3-2- آماده سازي اسپرم………………………………………………………………………………………………………………63
3-1-4- کشت داخل آزمايشگاهي جنين هاي حاصل از(IVF)………………………………………………………….64
3-1-5- تازه كردن محيط کشت جنين‌ها…………………………………………………………………………………………….65
3-2- تهيه محلول‌هاي انجمادي……………………………………………………………………………………………………………65
3-3- مراحل انجام روند انجماد شيشه اي…………………………………………………………………………………………….66
3-4- محيط ذوب…………………………………………………………………………………………………………………………………..66
3-5- گروههاي آزمايشي و طراحي مطالعه……………………………………………………………………………………………66
3-6- ارزيابي جنين‌ها
3-6-1- ارزيابي کيفي جنين‌ها با استفاده از رنگ‌آميزي افتراقي………………………………………………………….68
3-7- ايمونوسايتوشيمي پروتئينهاي سطحي جنين هاي گوسفندي(Sheep embryo ICC)……..70
فصل چهارم: نتايج
4-1- تخمکهاي منجمد شده
4-1-1- گروه آزمايشي اول، افزودن آلدوسترون به محيط IVM تخمکهاي
منجمد-ذوب شده در مرحله GV………………………………………………………………………………………………………….82
4-1-2- گروه آزمايشي دوم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم
جنيني (D4)، به محيط کشت جنينهاي حاصل از تخمکهاي منجمد-ذوب شده…………………………….82
4-1-3- گروه آزمايشي سوم، افزودن آلدوسترون در طي IVM،
ومتعاقباً انجماد تخمک ها در مرحله MII……………………………………………………………………………………………..83
4-1-4- گروه آزمايشي چهارم، يا گروه کننرل……………………………………………………………………………………..83
4-2- تخمک هاي منجمد نشده
4-2-1- گروه آزمايشي پنجم، افزودن آلدوسترون به محيط IVM تخمکهاي غير منجمد……………….85
4-2-2- گروه آزمايشي ششم، افزودن آلدوسترون در روز چهارم جنيني (D4)، به محيط کشت جنينهاي حاصل از تخمکهاي غير منجمد………………………………………………………………………………………………….85
4-2-3- گروه آزمايشي هفتم، يا گروه کنترل……………………………………………………………………………………….86
4-3-
فصل پنجم: بحث و پيشنهادات
بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..89
نتيجهگيري94
پيشنهادات95
منابع96
خلاصه انگليسي………………………………………………………………………………………………………………………………..113

فهرست جداول
عنوانصفحه
جدول 3-1- ترکيبات محيط HEPES buffered M19973
جدول 3-2- ترکيبات محيط Bicarbonate buffered M19973
جدول 3-3- ترکيبات محيطIVF medium “Fert. TALP”74
جدول 3-4- ترکيبات محيطRinsing medium “R. TALP”74
جدول 3-5- ترکيبات محيط Sperm medium “S. TALP”75
جدول 3-6- ترکيبات محيط H-SOF75
جدول 3-7- ترکيبات محيطي IVC- SOF76
جدول 3-8- Medium A76
جدول 3-9- مواد شيميايي و تجهيزات77
جدول 4-1- حضور آلدوسترون در محيط کشت در زمانIVM يا روز چهارم
کشت جنيني، در تکامل جنين حاصل از تخمک هاي منجمد-ذوب شده………………………………………………83
جدول 4-2- حضور آلدوسترون در محيط کشت در زمانIVM يا روز چهارم
کشت جنيني، در تکامل جنين حاصل از تخمک هاي تازه86
جدول 4-3- حضور آلدوسترون در محيط کشت در زمانIVM يا روز چهارم
کشت جنيني و تأثير آن بر تعدا سلول هاي در تعدادي از سلولهاي بلاستوسيست در تقسيم جنينهاي حاصل از تخمکهاي تازه86

فهرست نمودارها
عنوانصفحه
نمودار 4-1- تاثير آلدسترون روي بيان زيرواحد هاي ?1 و ?1 پمپ ATPase سديم
و پتاسيم در مدت IVM يا IVC – روز چهارم- در محيط کشت سلولهاي
بلاستوسيت. نوارها با حروف مختلف نشان دهنده تفاوت معنيدار ميباشد87
فهرست اشکال
عنوانصفحه
شکل 1-1- روند انجام اووژنزيزيس و اسپرماتوژنزيس10
شکل 1-2- روند انجام لقاح از زمان رشد تخمک11
شکل 1-3- تصاوير شماتيک مراحل نفوذ اسپرم به داخل تخمک21
شکل 1- 4- تصوير شماتيک روند تکامل جنين24
شکل 1-5- دو مکانيسم عملکرد مولکولي آلدوسترون38
شکل 1- 6- سيگنال هاي آلدوسترون39
شکل 1-7- ميزان اتصال سلول – سلول در توده سلولي رويان44
شکل 2-1- اتصالات سلولي در رويان در حال تقسيم ونقش آنها در تشکيل حفره
بلاستوسل و تعيين موقعيت سلولهاي ترفکتودرم و توده داخلي50
شکل2-2- فرايند تشکيل حفره بلاستوسل51
شکل2-3- ساز وکار کنترل فرايند هچ شدن بلاستوسيست53
شکل 2-4- پديد? فعال شدن ژنوم روياني56
شکل 3-1- رنگ آميزي افتراقي بلاستوسيت هاي مشتق از تخمک هاي منجمد69
شکل 3-2- رنگ آميزي ايمونوسيتوشيمي زير واحد هاي ?1 و ?1 پمپ Na+/K+ ATPase72
شکل 4-1- تصاوير مورولا و بلاستوسيست توليد شده در آزمايشگاه
جنين شناسي پژوهشگاه ابن سينا84
شکل 4-2- تصاوير بلاستوسيست هاي در حال تفريخ در آزمايشگاه
جنين شناسي پژوهشگاه ابن سينا84
چکيده
هدف: هدف از اين مطالعه بررسي تآثير آلدوسترون در افزايش توانمندي تکاملي تخمک هاي منجمد شده گوسفند با افزودن آلدوسترون در مرحله بلوغ تخمک و مرحله کشت جنيني مي باشد.
مواد و روش ها: تخمک هاي حاصل از تخمدان هاي کشتارگاهي، بطور تصادفي به شش گروه آزمايشي تقسيم شدند: گروه هاي يک و دو: بلوغ تخمک هاي (IVM) منجمد شده و تازه در حضور آلدسترون و متعاقباً لقاح آزمايشگاهي تخمک ها (IVF) و کشت جنين هاي حاصله (IVC) (به ترتيب گروه هايVit-IVM و IVM). گروه هاي سه و چهار: IVM و IVF تخمک هاي منجمد شده و تازه، و متعاقباً IVC جنين هاي حاصله در حضور آلدوسترون در روز چهارم (D4) کشت جنيني (به ترتيب گروه هاي Vit-D4 و D4). گروه هاي پنجم و ششم: IVM، IVF و IVC تخمک هاي منجمد شده ( Vit-Cont) و تازه (Fresh-Cont) بدون حضور آلدوسترون. جنين ها در مراحل مورولا و بلاستوسيت، توسط آنتي بادي هاي اوليه بر عليه زير واحدهاي?1 و ?1 پمپ Na+/K+/ATPase رنگ آميزي ايمونوسيتوشيمي شدند.
نتايج: ميزان تفريخ در گروه هايي که در IVM و يا IVC آنها آلدوسترون افزوده شده بود، در هر دو گروه تخمک هاي منجمد شده و تازه (به ترتيب گروه هاي Vit-IVM، IVM، Vit-D4 و D4) در مقايسه با گروه هاي کنترل (به ترتيب Vit-Cont. و Fresh-Cont.) به طور معني داري بيشتر بود. ميزان بيان تحت واحد ?1 پمپ Na+/K+/ATPase، در گروه هاي Vit-D4 و D4 به طور معني داري بيشتر از ساير گروه هاي بود. همچنين نسبت ICM/Total نيز به طور معني داري در گروه IVM بيشتر از ساير گروه ها بود.
بحث: به طور خلاصه، اضافه نمودن آلدسترون به محيط هاي کشت IVM و IVC مي تواند موجب افزايش معني دار ميزان تفريخ در هر دو گروه تخمک هاي منجمد شده و تازه گردد. اين افزايش ميزان تفريخ ممکن است با ميزان بيان بيشتر زير واحد ?1 پمپ Na+/K+/ATPase، که احتمالاً توسط افزودن آلدوسترون به محيط کشت القا گرديده است، در ارتباط باشد.
کليد واژه: آلدوسترون، گوسفند، جنين، تکامل، Na+/K+/ATPase، بيان
مقدمه و معرفي طرح
در سالهاي اخيرعلل مختلفي از قبيل بالا رفتن سن ازدواج، تعيير شيوه زندگي، عوامل عفوني و شيميايي، اشعه و شيمي درماني، مسائل ژنتيکي و يائسگي زود رس منجر به ناباروري زوجهاي بسياري شده و لذا انجماد و نگهداري تخمک اقدام اساسي در حفظ قدرت باروري و درمان ناباروري به شمار ميرود. با توجه به ضرورت حفظ و نگهداري تخمک در روشهاي کمک باروري1(ART) تلاشهاي زيادي جهت انجماد و نگهداري تخمکها صورت گرفته است، ليکن تاکنون روش قابل اعتمادي در انجماد تخمک که بتواند ميزان بالايي از زنده ماني تخمکها را نشان دهد گزارش نشده است. علي رغم بررسي هاي متعدد صورت گرفته بر روي تغييرات مورفولوژيک، فراساختاري، فيزيولوژيک و عملکردي تخمک هاي منجمد- ذوب شده، هنوز اطلاعات اندكي در خصوص وقوع تغييرات ملکولي و بيوشيميايي ايجاد شده در تخمک هاي مذکور و نيز الگوي بيان پروتيين هاي مرتبط با توان تكاملي تخمک ها پس از لقاح، به چشم مي خورد. با توجه به مطرح بودن اين گونه حيواني به عنوان حيوان مدل انسان براي مطالعات تخمدان و تخمک، خطر انقراض برخي از نژادهاي اين گونه جانوري، اهميت اين گونه حيواني از نظر اقتصادي (فراورده هاي دامي)، نقش آن به عنوان بيوراكتور در مطالعات مرتبط با توليد حيوان تراريخته و نيز عدم انجام مطالعه اي در خصوص بررسي ارتباط بين تجويز آلدوسترون و وضعيت بيان آنزيم Na+/K+/ATPase در روند تشکيل بلاستوسيست، در مطالعه حاضر به بررسي تاثيرآلدوسترون در بهبود کيفي تخمک هاي منجمد شده پرداخته خواهد شد.
بدين منظور تخمك هاي استحصال شده از تخمدان هاي كشتارگاهي گوسفند، در مرحله GV از تقسيمات ميوزي به روش کرايوتاپ و با استفاده از روش انجماد شيشه اي منجمد و پس از گذشت يك هفته ذوب شده و پس از لقاح، مراحل تكاملي آنها در شرايط آزمايشگاهي مورد بررسي قرار مي گيرد.
فصل اول
کليات

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

1-1- بيان مسئله
با وجود دستيابي به کارآيي نسبتاً بالا در تکنيک هاي انجماد اسپرم و جنين در پستانداران و از جمله گونه گوسفند، هنوز تکنيک مؤثري به منظور انجماد تخمک هاي اين گونه حيواني شناسايي نگرديده است. از جمله مهم ترين اهداف انجماد تخمک در نمونه هاي حيواني مي توان به حفظ و مديريت ذخاير ژنتيکي، توسعه علم مهندسي ژنتيک، ارتقاي تکنيک انتقال هسته2 (NT) در روند شبيه سازي، تهيه منابع کافي جهت انجام تحقيقات بنيادين، صادرات کم هزينه صفات ژنتيکي برتر و ايجاد بانک تخمك اشاره نمود. علاوه بر اين با حفظ و ذخيره سازي طولاني مدت اين منابع (تخمك) امکان اعمال برنامه هاي مديريتي قويتر در مورد گونه هاي جانوري در معرض خطر انقراض و در انسان نيز امکان حفظ باروري در زنان در معرض خطر اختلال در عملکرد تخمدان به علت درمانهاي خاص (شيمي و پرتو درماني)، جراحي، نارسايي زودرس تخمدان و … فراهم مي گردد؛ ضمن اين که انجماد تخمک در نمونه هاي انساني هيچ يک از مشکلات و محدوديت هاي اخلاقي و حقوقي انجماد جنين را نيز به همراه ندارد. مطالعات نشان مي دهند که در تخمک هاي منجمد- ذوب شده، آسيب هاي فراساختاري، مورفولوژيک، فيزيولوژيک و عملکردي متعددي به چشم مي خورد که مهم ترين آنها عبارتند از: وارد شدن صدمات غيرقابل برگشت به غشاء پلاسمايي تخمك، کاهش نفوذپذيري انتخابي غشاء پلاسمايي، اگزوسيتوز زودرس گرانول هاي کورتيکال، سفت و سخت شدن زوناپلوسيدا، کاهش شديد ميکروويلي ها، بهم ريختگي شديد اووپلاسم، تغييرات شديد و کاهش مشخص دستجات ميکروتوبول ها و ميکروفيلامان ها، بهم ريختگي دوک تقسيم و حرکت اجزاء اطراف سانتريول ها به مرکز تخمك، خرد شدن هسته، افزايش احتمال پارتنوژنزيس، کاهش شديد فاکتور پيشبرنده ميتوز MPF3، کاهش مشخص متابوليت ها و پروتئين ها، آنپلوييدي و پلي پلوييدي اشاره نمود .
در اين مطالعه به بررسي افزودن برخي عوامل مؤثر در روند اتجماد تخمک مانند آلدوسترون در محيط هاي اختصاصي کشت جنين و تأثير آنها بر بيان پروتيين مورد نظر (Na/K ATpase)در مراحل مختلف جنيني
مي پردازيم. بديهي است نتايج حاصل از اين مطالعه ضمن مشخص نمودن ميزان تاثير عامل افزوده شده بر روند تکامل تخمك و جنين هاي حاصله از انجماد، امكان ارتقاي كيفي روش هاي انجمادي تخمك مبتني بر نتايج بدست آمده را نه تنها در اين گونه جانوري بلكه در ساير پستانداران از جمله انسان فراهم نموده و بدين ترتيب گامي موثر در جهت رفع معضل تکامل تخمک هاي انجمادي از مورولا به بلاستوسيست در پستانداران برداشته خواهد شد. لازم به ذکر است تا به حال تأثير آلدوسترون در روند تکاملي جنين هاي حاصل از تخمک هاي منجمد- ذوب شده گوسفند بررسي نگرديده است و در صورت وجود تأثير مثبت در اين زمينه، موجب تحول روش هاي انجماد تخمک در گوسفند و حتي ساير گونه ها خواهد شد .
1-2- اهداف پژوهش
1- بررسي تأثير هورمون آلدوسترون افزوده شده در طي IVM و مراحل مختلف جنيني بر عملکرد پمپ هاي Na+/K+/ATPase موجود در غشاي بازولترال تروفکتودرم جنيني و برطرف شدن توقف جنين هاي حاصل از تخمک هاي منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا .
2- ارتقاي پروتکل هاي انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقاي کيفي(جنينهاي حاصله از افزايش ميزان تفريخ، ICM/Total) عملکرد اجزاي داخل سلولي و يا کاهش آسيب هاي ساختاري تخمک در روند تکامل جنين هاي حاصل از تخمک هاي منجمد- ذوب شده .
1-3- ضرورت انجام تحقيق
اين پروژه با هدف پاسخ به برخي از سؤال هاي زير طراحي گرديد: بررسي تأثير هورمون آلدوسترون افزوده شده در مراحل مختلف جنيني بر عملکرد پمپ هاي Na+/K+/ATPase موجود در غشاي بازولترال تروفکتودرم جنيني و برطرف شدن توقف جنين هاي حاصل از تخمک هاي منجمد- ذوب شده، در مرحله مورولا؛ بررسي ارتباط بين تجويز هورمون هاي فعال کننده تحت واحد هاي 1? و 1? پمپ Na+/K+/ATPase و ميزان افزايش عملکرد آنزيم مذکور در مرحله انتقال از مورولا به بلاستوسيست و متعاقباً بهبود روند تکاملي جنين هاي حاصل از تخمک هاي منجمد- ذوب شده و ارتقاي پروتکل هاي انجماد تخمک در گوسفند با هدف ارتقاي عملکرد اجزاي داخل سلولي و يا کاهش آسيب هاي ساختاري تخمک در روند تکامل جنين هاي حاصل از تخمک هاي منجمد- ذوب شده .
1-4- توليد جنين در شرايط In vivo
1-4-1- روند ايجاد سلول جنسي ماده4
واحدهاي عملكردي تخمدان فوليكول نام دارند كه تحت سازماندهي سلولي خاص تخمک را در خود جاي داده‌اند. اين سازماندهي سلولي ثابت نبوده و در طي مراحل مختلف زندگي فوليكول تغييرات پيچيده‌اي مي‌يابد. حاصل اين تغييرات به آزاد شدن تخمک5 و يا تحصيل فوليكول رسيده منجر خواهد شد ]132،54[.
توليد مثل با تكامل تخمك‌ها در تخمدان آغاز مي‌گردد. تعداد 1 تا 25 تخمك، بسته به گونه حيوان، در مرحله‌اي از سيكل جنسي حيوان ماده به نام فاز اوولاسيون6 از فوليكول تخمداني به داخل حفره شكمي آزاد مي‌شوند. سپس اين تخمك‌ها از طريق لوله رحمي مربوطه وارد رحم مي‌شوند. فوليكول‌هاي تخمداني متعددي در مراحل مختلف تكاملي در استروماي كورتكس واقع شده‌اند. بيشترين فوليكول‌ها، فوليكول‌هاي پريمورديال7 هستند. هر فوليكول پريمورديال حاوي يك تخمک اوليه است كه توسط يك لايه از سلول‌هاي فوليكولي سنگفرشي احاطه شده است. در ادامه رشد اين فوليكول‌ها، سلول‌هاي فوليكولي تبديل به سلول‌هاي مكعبي يا استوانه‌اي كوتاه مي‌شوند ]148،81 [.
مجموع وقايعي كه منجر به توليد سلول زايايي تخمک در جنس ماده مي‌شود، باعث بروز تمامي واكنش‌هاي لازم قبل، حين و بعد از واكنش با اسپرم در تخمک مي ‌شود که شامل يك پروسة طولاني از تمايز اووگوني در تخمدان جنيني تا بلوغ نهايي تخمک، درست قبل از اوولاسيون آن مي‌باشد.
از مدت‌ها قبل مشخص شده كه فقط تعداد كمي از تخمک‌هاي اوليه حيوانات و نيز انسان مي‌توانند رشد ثانويه خود را دنبال کرده، تبديل به تخمک ثانويه شده و تخمك‌گذاري كنند. بطور مثال در مورد گاو تخمين زده اند که در تخمدان‌هاي گوساله تازه متولد شده حدود 200.000 تخمک وجود دارد که احتمالاً كمتر از 300 عدد آن‌ها به مرحله تخمك‌گذاري مي‌رسند] 52،136،20[.
در فرآيند بلوغ، اووسيت اوليه، پروفاز نخستين تقسيم ميوزي پس از تولد را تکميل مي‌کند. در زمان بلوغ، تغييرات بعدي رخ مي‌دهند. اووسيت اوليه حاوي تعدادي کرموزوم‌هاي ديپلوئيد (xx) است. به طوري که در مرحله‌ي بلوغ، اووسيت بزرگ شده، سلول‌هاي فوليکولي، مکعبي و به چندين لايه تکثير مي‌يابند. همچنين يک غشاي مخطط به نام زوناپلوسيدا8، پيرامون اووسيت تشکيل مي‌شود (اين لايه با به هم پيوستن زوايد اووسيت اوليه و گليکوپروتئين موجود در محل تشکيل شده است)، فوليکول بزرگ شده و فضاهاي پر از مايع، بين سلول‌هاي فوليکولي، پديدار شده و به هم مي‌پيوندند تا آنتروم فوليکول9 را تشکيل دهند. به همين دليل، سلول‌هاي فوليکولي، تفکيک مي‌شوند تا لايه‌ي گرانولوزوم10 و کومولوس اووفوروس11، را تشکيل دهند. تک خارجي12 (لايه‌ي فيبروزي) و تک داخلي13 (لايه‌ي عروقي و سلولي) به وسيله‌ي سلول‌هاي استرومايي تخمدان در خارج از لايه‌ي گرانولوزوم، به وجود آمده و به اين ترتيب، فوليکول گراف بالغ به وجود مي‌آيد. اووسيت اوليه، نخستين تقسيم ميوزي را که در خلال حيات پيش از تولد آغاز شده بود، کامل مي‌کند. در نتيجه دو سلول دختر هر يک با تعداد کروموزوم‌هاي هاپلوئيد (n) تشکيل مي‌شوند. در اين فرآيند تقسيم هسته‌اي برابر بوده اما تقسيم سيتوپلاسمي نابرابر است. بنابراين يک سلول دختر که سيتوپلاسم فراواني از سلول مادر دريافت کرده، بزرگ مي‌شود. اين سلول اووسيت ثانويه ناميده مي‌شود. سلول کوچک، نخستين گويچه‌ي قطبي14 است که در فضاي پيرامون زرده‌اي15 جاي داده مي‌شود. در شکل 1-1 روند کلي انجام اووژنز آمده است.
تخمک گذاري16، هنگامي رخ مي‌دهد که يک فوليکول گراف بالغ در سطح تخمدان، پاره شود. تخمک‌گذاري مي‌تواند در هر نقطه از سطح، به جز ناف تخمدان صورت گيرد. در اين فرآيند، اووسيت ثانويه‌ي احاطه شده به وسيله‌ي زوناپلوسيدا و سلول‌هاي کومولوس اوفوروس از تخمدان بيرون رانده مي‌شوند.
1-4-1-1- ويژگي‌هاي اووسيت ثانويه
الف: از ساير سلول‌ها بزرگتر است. قطر آن نزديک به 150 ميکرومتر است.
ب: غشاي سلولي آن، غشاي زرده‌اي17 ناميده مي‌شود. اين غشا به وسيله‌ي زوناپلوسيدا، پوشيده شده است.
ج: فضاي بين غشاي زرده‌اي و زوناپلوسيدا فضاي پيرامون زرده‌اي ناميده مي‌شود.
د: هسته بزرگ خارج مرکزي و حاوي نيمي از کروموزوم‌ها است.
ه: در بيشتر پستانداران، اووپلاسم18 يا زرده شبيه به سيتوپلاسم سلول‌ها‌ي ديگر است. اين نوع تخم‌ها، تخم‌هاي
ميکرولسيتال19 (کم زرده) ناميده مي‌شود. تخم‌هاي پرندگان، حاوي زرده سرشار از مواد مغذي (ديوتوپلاسم) بوده و به همين سبب تخم‌هاي ماکرولسيتال20 (پرزرده) ناميده مي‌شوند.
اووسيت‌هاي پستانداران عالي، حاوي زرده‌‌ي اندکي هستند که تقريباً يکنواخت و پراکنده بوده و بنابراين تخم‌هاي ايزو لسيتال21 ناميده مي‌شوند.
و: سلول‌هاي پيرامون اووسيت، به طور شعاعي به زوناپلوسيدا، متصل شده‌اند. اين لايه‌هاي سلولي تاج مشعشع22 ناميده مي‌شوند.
ز: سانتروزوم23 با دو سانتريول24، مجاور هسته قرار گرفته است ] 22[.
1-4-2- روند ايجاد سلول جنسي نر25
فرآيند تبديل سلول‌هاي جنسي اوليه‌ي نر به اسپرم، نتيجه‌ي مجموعه‌اي از تغييرات شيميايي و فيزيکي است. اين فرآيند از زمان بلوغ آغاز مي‌شود. سلول‌هاي جنسي اوليه‌ي نر، از راه ميتوز تقسيم شده و اسپرماتوگونيا را به وجود مي‌آورند، آن‌ها تمايز مي‌يابند تا اسپرماتوسيت‌هاي اوليه را به وجود آورند که هر يک از آن‌ها حاوي همان تعداد کروموزوم‌هاي ديپلوئيد (2n) معمول گونه است. هر اسپرماتوسيت اوليه، دستخوش تقسيم کاهشي (ميوز I) شده و دو سلول اسپرماتوسيت‌هاي ثانويه را به وجود مي‌آورند. بنابراين، اسپرماتوسيت‌هاي ثانويه، حاوي تعداد کروموزوم‌هاي هاپلوئيد (n) هستند. هر اسپرماتوسيت ثانويه، ديگر بار با تقسيم غيرکاهشي (ميوزII )، تقسيم شده و اسپرماتيد‌ها را به وجود مي‌آورد.
اسپرماتيد‌ها از راه فرآيند اسپرميوژنز26، بدون هيچ تقسيم سلولي، متحمل تغيير شکل متامورفولوژيکي27 شده و به اسپرماتوزوآ تبديل مي‌شوند. وزيکول‌هاي گلژي28 به هم مي‌پيوندند تا کلاهک سري تشکيل شود. سانتريول خلفي، فيلامنت‌هاي محور29 بدنه و دم را به وجود مي‌آورد. ميتوکندري‌ها به شکل مارپيچي، آرايشي دوباره يافته و غلاف ميتوکندريايي30 را تشکيل مي‌دهند و اسپرماتيد طويل مي‌شود]141[در شکل 1-1 روند کلي اسپرماتوژنز آمده است.
شکل 1-1- روند انجام اووژنزيزيس و اسپرماتوژنزيس]141[
1-4-3- لقاح
فرآيندي است که در خلال آن دو سلول جنسي بالغ (يک اسپرم و يک تخمک) در هم آميخته و يک سلول واحد به نام سلول تخم را تشکيل مي‌دهند. بنابراين سلول تخم، يک سلول ديپلوئيد تمايز نيافته است که از در هم آميختن دو گامت هاپلوئيد بسيار تخصص يافته تشکيل شده است . لقاح در لوله‌ي رحمي رخ مي‌دهد. در زمان لقاح، اووسيت ثانويه (هاپلوئيد)، در پي توليد شدن از اووسيت اوليه با فرآيند نخستين تقسيم کاهش ميوزي، آزاد مي‌شود. اووسيت ثانويه، به لوله‌ي رحمي رسيده و در تماس با اسپرماتوزوآ قرار مي‌گيرد.
در هر انزال31 ، نزديک به 200 تا 300 ميليون اسپرم، آزاد مي‌شود. از اين تعداد، نزديک به 500 اسپرم به محل لقاح مي‌رسند. تنها يک اسپرم پس از گذشتن از سد تاج مشعشع، زوناپلوسيدا و غشاي زرده‌اي اووسيت ثانويه، به اووسيت مي‌پيوندند. ساير اسپرم‌هايي که به تخمک رسيده‌اند، درگير تجزيه‌ي ماتريكس بين سلول‌هاي تاج مشعشع به وسيله‌ي ترشح آنزيم هيالوروينداز32 مي‌شوند. بقيه‌ي اسپرم‌ها در عرض 24 ساعت پس از انزال مي‌ميرند. پس از لقاح وقايع زير رخ مي دهد:
1-اووسيت ثانويه، به محض ورود اسپرم، دومين تقسيم ميوزي (بلوغ) را کامل کرده و همچنان که دومين گويچه‌ي قطبي33 را به بيرون از غشاي زرده‌اي (فضاي پيرامون زرده‌اي) مي‌راند، يک تخمک بالغ را تشکيل مي‌دهد.
2- هسته‌ي تخمک بالغ، پيش هسته‌ي ماده34 ناميده مي‌شود. هم زمان، سر اسپرم، متورم مي‌شود تا پيش هسته‌ي نر35 را تشکيل دهد . هر دو پيش هسته، در هم آميخته و تعداد کروموزوم ديپلوئيد، دوباره در سلول تخم، بر قرار مي‌شود.
3- جنسيت کروموزومي36، تعيين مي‌شود. اگر اسپرم حاوي کروموزوم x ، تخمک را بارور کند، نتاج ماده شده و اگر يک اسپرم حاوي کروموزوم Y، تخمک را بارور کند يک حيوان نر، به وجود مي‌آيد.
شکل 1-2- روند انجام لقاح از زمان رشد تخمک]141[
1-4-4- تسهيم
پس از تشکيل تخم، رويان متحمل تقسيمات ميتوزي متعددي مي‌شود. سلول تخم در مقايسه با سلول‌هاي غير جنسي بدن داراي نسبت سيتوپلاسم به هسته بيشتري است. طي تقسيماتي که اين سلول انجام مي‌دهد، اين نسبت به تدريج کوچکتر مي‌شود ، يعني از مقدار سيتوپلاسم آن به تدريج کم شده و هسته آن نسبتاً بزرگ‌تر مي‌شود. اين نوع تقسيمات را تسهيم گويند.
از طرفي الگو و نحوه تسهيم به ميزان زرده‌اي که در زايگوت موجود است بستگي خواهد داشت . در پرندگان حجم زياد زرده مانع از تقسيم کامل زايگوت شده ، بنابراين کليواژ نسبي37 و مروبلاستيک38 است. کليواژ کامل39 يا هلو بلاستيک40 در پستانداران جفت‌دار که زايگوت داراي حداقل مقدار زرده است رخ مي‌دهد. تقسيمات ميتوزي رويان را مي‌توان به مراحل مختلف تقسيم کرد .
پس از اولين تقسيم، سلول تخم به رويان دو سلولي تبديل مي‌شود و هر يک از اين سلول‌ها که اينک يک بلاستومر41 ناميده مي‌شود ، مجدداًً چندين بار تقسيم شده به ترتيب رويان‌هاي چهار سلولي ، هشت سلولي و شانزده سلولي را به وجود مي‌آورند. در هر يک از اين مراحل بلاستومر‌ها به طور هم زمان دچار تقسيمات ميتوزي مي‌شوند. حدوداً از مرحله‌ي شانزده سلولي به بعد در گاو، هم زماني تقسيم ميتوز بين بلاستومر‌ها از بين مي‌رود و سلول‌ها از نظر فيزيولوژيکي تفرق مي‌يابند. به عبارت ديگر تا مرحله شانزده سلولي هر يک از سلول‌ها قادرند که پس از چند تقسيم ميتوزي به يک رويان تبديل شوند ولي از مرحله شانزده سلولي به بعد سلول‌ها به گروه‌هاي مختلف (از نظر فيزولوژيکي) تقسيم شده و تقسيم وظايف مي‌شوند.
زماني که رويان به مرحله شانزده سلولي رسيد مورولا42 ناميده مي‌شود . در مرحله‌ي مورولا بلاستومر‌ها از حالت کروي خارج مي‌شوند و جداره‌ي سلول‌ها در تماس کامل با يکديگر قرار مي‌گيرند و نهايتاً يک توده‌ي سلولي کروي شکل ر ا به وجود مي‌آورند. در اين مرحله آن را مورولاي متراکم43 مي‌گويند. تماس سلول‌ها به خصوص سلول‌هايي که در حاشيه‌ي توده‌ي سلولي مورولاي متراکم قرار دارند، سبب مي‌شود مايعاتي که وارد سلول‌ها شده، نتواند به راحتي از آن خارج شود.
هم‌زمان با انباشته شدن مايع در داخل توده‌ي سلولي، سلول ها به دو گروه تقسيم مي‌شوند . بخشي از آن‌ها در حاشيه قرار مي‌گيرند و تشکيل کيسه‌اي به نام تروفکتودرم44 را مي‌دهند. سلول‌هاي تشكيل دهنده اين لايه را تروفوبلاست45 يا سلول‌هاي حاشيه‌اي مي‌گويند. بقيه سلول‌هاي رويان كه در داخل كيسه‌ي تروفكتودرم قرار دارند به تدريج دور يکديگر تجمع مي‌يابند و تشکيل توده‌ي سلولي داخلي46 را مي‌دهند. سلول‌هاي تشکيل دهنده توده سلولي را سلول‌هاي روياني يا امبريوبلاست47 مي‌نامند. سلول‌هاي روياني مسئول ساختن بافت‌هاي مختلف بدن نوزاد هستند و سلول‌هاي حاشيه‌اي نيز پس از تحمل تغييراتي، به خارجي‌ترن لايه پرده‌هاي روياني، يعني لايه‌ي کوريون48 تبديل مي‌شوند.
ترشحات بلاستومر‌ها در داخل مورولاي متراکم جمع شده و حفره‌ي پر از مايعي را تشکيل مي‌دهند. اين مايعات در فضايي که در حد فاصل بين توده سلولي و لايه تروفکتودرم ايجاد مي‌شود، تجمع مي‌يابند. در نتيجه تجمع اين مايعات، توده سلولي فشرده شده و به گوشه‌اي رانده مي‌شود. فضايي را که اين مايعات اشغال مي‌کنند، بلاستوسل49 و رويان بلاستوسل‌دار را بلاستوسيست50 يا بلاستولا مي‌نامند. به تناسب رشد بلاستوسيست، بلاستوسل به تدريج بزرگتر شده و توده سلولي کوچک‌تر مي‌شود . بر همين اساس مرحله بلاستوسيست را مي‌توان به بلاستوسيست اوليه51، بلاستوسيست و بلاستوسيست پيشرفته52 تقسيم کرد.
در مرحله بلاستوسيست پيشرفته، بخش اعظم رويان به وسيله بلاستوسل اشغال مي‌شود و توده‌ي سلولي تنها گوشه‌اي از حجم رويان را پر مي‌کند. از اين مرحله به بعد، افزايش حجم مايع بلاستوسل و رشد توده سلولي به گونه‌اي است که لايه‌ي شفاف نمي تواند آن را تحمل نمايد. لذا لايه شفاف به تدريج نازک‌تر شده و نهايتاً پاره مي‌شود.
پس از پاره شدن آن، رويان که اينک شامل توده سلولي، لايه حاشيه‌اي و حفرة بلاستوسل است، از لايه شفاف خارج شده، پس از آن مي‌تواند به راحتي افزايش حجم يابد. رويان را در اين مرحله بلاستوسيست آزاد53 مي‌گويند ] 73، 13[ .
1-5- توليد جنين در شرايط In vitro
توليد جنين در شرايط آزمايشگاه شرايط توليد مقادير انبوه جنين در مراحل تکاملي گوناگون را ايجاد ميکند و از اينرو بسيار مورد استقبال دانشمندان علومزيستي توليد مثلي و بيوتکنولوژي قرار گرفته است.
برخي کاربردهاي اين تکنيک عبارتند از:درمان ناباروري بهويژه در انسان، ايجاد روشهاي نوين تعيين جنسيت جنين، درمان بيماريها با استفاده از سلولهاي بنيادي، مقاصد دارويي، تحقيقات در تمامي جنبههاي شبيهسازي، پيشرفت فناوري تزريق ژن، مطالعهي مراحل مختلف جنيني و کاربردهاي تجاري همانند تسهيل دوقلوزايي در گلههاي گوشتي، سرعت بخشيدن به برنامههاي اصلاح نژاد، نجات گونههاي در حال انقراض و بسياري کاربردهاي ديگر[72،128].
پيشرفت موفقيتآميز و کاربرد گسترده اين روشها و فناوريهاي وابسته، ارتباط تنگاتنگي با گسترش فناوريهاي پايه مرتبط با بلوغ آزمايشگاهي اووسيت54، لقاح آزمايشگاهي55، کشت آزمايشگاهي جنين56، تکنيکهاي انتقال جنين57 و روشهاي کشت اسپرم در آزمايشگاه دارد.
در ابتدا در بسياري از موارد، کار بر روي تخمدانهاي جمعآوري شده از کشتارگاهها انجام ميگرفت. امروزه نيز استفاده از نمونه هاي حاصل از کشتارگاه کاربرد فراواني دارد، البته هماکنون يکي از روشهاي متداول، برداشت اووسيت با استفاده از روشهاي اولتراسونوگرافي از حيوانات بارور يا نابارور ميباشد.
1-5-1- بلوغ آزمايشگاهي تخمک (IVM)
بلوغ آزمايشگاهي تخمک روند بسيار پيچيده است که هنوز تمامي جنبههاي آن هنوز به درستي شناخته نشده است. در بلوغ آزمايشگاهي تخمکميبايست محيط ميکروآندوکريني مناسب جهت بلوغ اووسيت فراهم گردد. در چنين شرايطي اووسيت هاي نابالغ ميتوانند مراحل بلوغ سيتوپلاسمي و هستهاي را با موفقيت پشت سر گذارند.
پيشينه پژوهشها در زمينهي بلوغ آزمايشگاهي اووسيت به هفتاد سال پيش مي گردد. زماني که پينکوس و همکارانش دريافتند که تعدادي از اووسيتهاي نابالغ خرگوش پس از رها شدن از فوليکول آنترال و کشت در محيط مناسب ميوز را از سر ميگيرند[121].
در اکثر پستانداران تخمکهاي فوليکولهاي تخمداني در طي دوران جنيني وارد مرحلهي ميوزي از تقسيمات هستهاي شده و تا قبل از زمان فراخواني (تخمک گذاري يا آترزي) در مرحلهي پروفازI از تقسيم ميوزي متوقف باقي خواهد ماند(تا قبل از مرحلهي بلوغ جنسي). در شرايط خارج سازي تخمک از فوليکول و انتقال آن به مدياي کشت مهار اعمال شده از جانب سلولهاي گرانولوزا برداشته شده و لذا تقسيم ميوزي از سر گرفته خواهد شد[122،36].
با اين وجود در شرايط بلوغ آزمايشگاهي علي رغم اينکه حدود 80-70 درصد از تخمکهاي کشت داده شده به مرحلهي متافاز II از تقسيمات هستهاي ميرسند ليکن توليد بلاستوسيست پس از انجام لقاح خارج رحمي به طور متوسط 30 درصد خواهد بود که علت اين امر را ميتوان تا حدود زيادي مربوط به نقصان بلوغ سيتوپلاسم دانست.
تخمکهاي مورد نياز براي رويان آزمايشگاهي از فوليکولهاي تخمدانهايي که در کشتارگاه جمعآوري ميشوند به دست ميآيد[179]. به منظور انتقال تخمدان به آزمايشگاه از ظرفهاي عايق حرارتي استفاده ميگردد تا در معرض نوسانات حرارتي کمتري قرار گيرند.
در آزمايشگاه بافتهاي اضافي را از تخمدان جدا نموده و تخمدانها را بهوسيله محلولهاي مناسب شستشو ميدهند، سپس با سرنگ و پمپ خلاء و سرسوزن مناسب و يا با روشهاي ديگر محتويات فوليکولهايي را که در سطح تخمدان هستند تخليه نموده و در لوله آزمايش مناسب قرار ميدهند. از اوايل دهه 1990 گرفتن تخمک از حيوانات دهندهي زنده در شرايط طبيعي از راه پاره کردن فوليکول به کمک لاپراسکوپي و اولتراسونوگرافي در حال گسترش است[78].
امااين روشها گران قيمت و ميزان تخمک استحصالي بهازاي هر تخمدان بسيار کم است[119]. در گذشته از تکنيک جداسازي فوليکول آنترال کامل58 به منظور دستيابي به تخمک استفاده ميشد اما روشهاي برش تخمدان59[166] و آسپيراسيون60[169]در گوسفند معمولتر ميباشد. يکي از رايجترين روشهاي استحصال تخمکها از تخمدانهاي بهدستآمده از کشتارگاه، آسپيراسيون ميباشد[169]. يکي از مشکلات اين رهيافت اين است که تنها 30 تا60 درصد تخمکها از فوليکولها استحصال ميشود در حالي که با تکنيک جداسازي فوليکول درصد استحصال تخمکها از فوليکولها به صددرصد نيز ميرسد. برتري اين تکنيک سرعت اجراي آن است، آسپيراسيون سه بار سريعتر از جداسازي است. فوليکولهايي با قطر 8-2 ميليمتر با نيدل اندازه 22-18 متصل به پمپ خلاء با فشار 100-75 ميليمتر جيوه آسپيره ميشوند[46]. افزايش فشار خلاء موجب کاهش تخمکهايي با کيفيت مطلوب و زيستپذير شده که احتمالا?به دليل کنده شدن سلولهاي کومولوس از اووسيت است. هنگامي که فشار خلاء بالاست افزايش چشمگيري در تعداد تخمکهاي برهنه61 ديده ميشود. با افزايش فشار آسپيراسيون تعداد COCs62 کاهش مييابد[16]. گفته ميشود تکنيک برش تخمدان سهبار کندتر از آسپيراسيون است اما با اين روش ميتوان تعداد تخمکهاي استحصالي را افزايش داد.
جداسازي تخمکهاي واجد شرايط براي توليد جنين از اهميت ويژهاي برخوردار است. بر اساس آزمايشهاي انجام شده تنها آن دسته از تخمکهاي نارس قدرت بالغ شدن دارند که داراي چندين رديف سلول کومولوس بهصورت متراکم و يکنواخت در اطراف خود بشند و سيتوپلاسم تخمکها يا اووپلاسم آنها نيز ترکيب يکنواختي داشته باشد. تخمکهاي بدون سلول کومولوس يا داراي سلولهاي کومولوس پراکنده و يا تخمکهاي حاوي اووپلاسم قطعه قطعه شده، فاقد توانايي لازم جهت بالغ شدن هستند.
تحقيقات نشان ميدهد که در گوسفند فوليکولهايي که قطر آنها بين 6-2 ميليمتر ميباشد، حاوي تخمکهاي واجد شرايط براي بالغ شدن در شرايط آزمايشگاهي هستند و تخمکهايي که از فوليکولهايي با قطر کمتر از 2 ميليمتر و يا با قطر بيش از 6 ميليمتر تهيه ميشوند به ترتيب داراي سلولهاي کومولوس کم و يا زياد ولي پراکنده بودهاند قابليت بارورشدن را ندارند. در عين حال جمعآوري تخمک در آزمايشگاه معمولا از تمامي فوليکولهايي که در سطح تخمدان حضور دارند صورت ميگيرد و ملاک انتخاب آنها مشخصات ظاهري خود تخمکها است که در زير ميکروسکوپ قابل مشاهده ميباشند.
ملاک بالغ شدن تخمک در شرايط آزمايشگاهي تداوم يافتن تقسيمات ميوزي هسته تخمک و ظاهر شدن اولين گويچه قطبي(بلوغ هسته) و تغيير در فعاليت و نحوه استقرار ارگانلهاي سيتوپلاسمي (بلوغ سيتوپلاسم)است. بنابر اين براي انجام IVM موفق، بايستي بلوغ هستهاي به همراه بلوغ سيتوپلاسمي در شرايط آزمايشگاه صورت پذيرد، بهطوري که حوادثي که در طي بلوغ تخمک رخ ميدهد، پيشرفتهاي جنيني را تحت تاثير قرار ميدهد[155]محيط کشت داراي بيشترين اثر در بلوغ تخمک است، يکي از بهترين محيطها و بهطور معمول محيطي که به منظور بلوغ تخمکهاي گوسفند و بز بهکار رفته است TCM19963 ميباشد. اسيديته اين محيط را بس از آماده نمودن آن، بهوسيلهي يونهاي بيکربنات يا محلول HEPES متعادل نموده و محيط را پس از غنيسازي با سرم و هورمونهاي مختلف مورد استفاده قرار ميدهند. افزودن گنادوتروپينها64 (LH65،66FSH)و استراديول به محيط بلوغ بهطور معناداري موجب افزايش ميزان بلوغ گرديده [48،30،75]که بهطور اوليه باعث تنظيم نمودن بلوغ هستهي تخمک پستانداران ميشود و اثرات سودمندشان براي تخمکهايي که از حيوانات جوان نابالغ استحصال ميشود مشخصتر است[80]. استراديول نيز با تحريک DNA polymerase B و افزايش سنتز فاکتور مورد نياز براي رشد پرونوکلئوس نر باعث انجام بلوغ سيتوپلاسمي ميشود.همچنين در حضور استراديول ميزان توليد بلاستوسيست افزايش مييابد[118].
عموما به محيط بلوغ ميزان 10-20 درصد سرم که در 56 درجه سانتيگراد به مدت 30 دقيقه حرارت داده ميشود67، نيز اضافه ميشود. حرارت باعث غير فعال شدن فاکتورهاي نامساعدي چون کمپلمان ميشود.سرم بهعنوان يک منبع غذايي براي COCs مطرح ميشود،همچنين از سخت شدن زونا68 زماني که تخمک از محيط اطراف فوليکول آزاد ميشود، جلوگيري ميکند[168]در گوسفند و بز در بيشتر مطالعات سرم مورد استفاده FBS ميباشد[12،7،3].
غني نمودن مدياي IVM با مايع فوليکولي از فوليکولهاي غيرآترتيک و يا فوليکولهاي بزرگتر از 4 ميليمتر که تحت تاثير گنادوتروپينها قرار گرفتهاند، اثرات سودمندي خواهد داشت. بهطوري که اضافه نمودن مايع فوليکولي انسان يا گوسفند باعث افزايش راندمان لقاح تخمکهاي گوسفند شده که اين احتملا به دليل حضور فاکتورهاي رشد ميباشد[26]. سپس تخمکها به منظور طي نمودن روند بلوغ در محيط مطلوب در شرايط 38-39 درجه سانتيگراد در 5 درصد CO2،رطوبت حداکثر به مدت 32-26 ساعت انکوبه ميشوند. به نظر ميرسد زمان انکوباسيون براي بلوغ تخمکهاي بز نسبت به گوسفند طولانيتر باشد، بهطوري که در يکسري مطالعات عنوان شده که با کشت تخمکهاي بز در مدياي TCM-199 به همراه 20 درصد FBS به مدت 32 ساعت نتايج بهتري حاصل ميشود[145،144].
1-5-2- ظرفيت پذيري اسپرم


دیدگاهتان را بنویسید