2-4-2-عفونت هاي مجاري ادراري13
2-4-3-اندوکارديت13
2-4-4-عفونت هاي داخل شکمي، لگني وبافت هاي نرم13
2-4-5-ساير عفونت هاي انتروکوکي14
2-5-شناسايي انترکوک‏ها14
2-6-درمان انترکوک‏ها15
2-6-1-مقاومت آنتي بيوتيکي16
2-6-1-1-مقاومت به گليکوپپتيدها17
2-6-1-1-الف- عوامل زمينه ساز کلنيزاسيون انتروکوک هاي مقاوم به ونکومايسين(VRE)17
2-6-1-2-مقاومت به آنتي بيوتيک هاي بتالاکتام19
2-6-1-3-مقاومت به آنتي بيوتيک هاي تتراسايکلين20
2-6-1-4-مقاومت به لينکوزاميدها20
2-6-1-5-مقاومت به استرپتوگرامين B وA21
2-6-1-6-مقاومت به اگزازوليدون21
2-6-1-7-مقاومت به اورني مايسين22
2-6-1-8-مقاومت در برابر آنتي بيوتيک هاي ماکروليدي22
2-6-1-9-مقاومت به کلرامفنيکل23
2-6-1-10-مقاومت به آمينوگليکوزيدها24
2-6-1-10-الف- تاريخچه روند گسترش مقاومت هاي آمينوگليکوزيدي25
2-6-1-10-ب- انواع مقاومت به آمينوگليکوزيدها25
2-6-1-10-پ- اهميت مقاومت آمينوگليکوزيدي27
2-6-1-10-ت-HLAR و و افزايش مرگ ومير28
2-6-2-مقاومت چنددارويي( MDR)28
2-7- روش هاي شناسايي سويه هاي مقاوم به آنتي بيوتيک29
2-7-1- روش هاي مبتني بر فنوتيپ29
2-7-1-1- روش انتشار ديسک در آگار( ديسک ديفيوژن)29
2-7-1-2- روش تهيه رقت در محيط مايع( براث ديلوشن )30
2-7-1-3 – روش تهيه رقت در محيط آگار( آگار ديلوشن )30
2-7-2- روش هاي مبتني بر ژنوتيپ31
2-7-2-1-Triplex-PCR31
2-7-2-1-الف-طراحي واجرايTriplex-PCR32
2-7-2-1-ب-تيتراسيون اجزاي واکنش33
2-7-2-1-3 -شرايط ترموسايکلر33
2-8-اپيدميولوژي عفونت هاي انتروکوکي33
2-9-مروري بر پيشينه پژوهش35
فصل سوم – مواد و روش‏ها
3-1-وسايل موردنياز40
3-2-مواد موردنياز41
3-3-طريقه ساخت محيط هاي کشت43
3-3-1-محيط بلادآگار43
3-3-2-محيط BHI براث43
3-3-3-محيط مولر هينتون آگار44
3-3-4-محيط پايه قند44
3-4-جمع آوري نمونه45
3-5-جدا سازي سويه ها45
3-6-نگهداري سويه ها46
3-7-آنتي بيوگرام46
3-7-1-تهيه سوسپانسيون باکتريايي46
3-7-2-روش آنتي بيوگرام47
3-8-بررسي مقاومت افزايش يافته به جنتامايسين و استرپتومايسين48
3-9-اجراي PCR48
3-9-1-آماده سازي واستخراج ژنوم48
3-9-1-1-جوشاندن49
3-10-اندازه گيري غلظت DNA ژنوميک تخليص شده49
3-11-الکتروفورز محصول استخراج ژنوم50
3-12-انتخاب و سنتز پرايمر50
3-13-روش آماده سازي پرايمرها51
3-13-1-محلول کاري پرايمر PCR51
3-13-2- ترکيب واکنش PCR براي هر نمونه52
3-14-انجام واکنش PCR52
3-15-طريقه ساخت بافر54

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

3-15-1-تهيه بافر(SX )TBE54
3-15-2-تهيه ژل Buffer Loading Gel54
3-16-تهيه ژل الکتروفورز55
3-16-1-تهيه‌ي ژل آگاروز جهت انجام الکتروفورز ژنوم اسنخراج شده و محصول PCR55
3-17-تعيين توالي55
فصل چهارم – نتايج و بحث
4-1-نتايج مربوط به جداسازي گونه هاي انتروکوکي از نمونه هاي باليني56
4-2-نتايج حاصل از کشت انتروکوک ها بر روي محيط و رنگ آميزي گرم57
4-3-نتايج حاصل از حساسيت آنتي بيوتيکي به روش ديسک ديفيوژن61
4-4-نتايج حاصل از استخراج61
4-5-نتايج PCR62
4-6-بحث66
فصل پنجم – نتيجه‏گيري
5-1- نتيجه‏گيري71
5-2-پيشنهادات72
منابع فارسي73
منابع غيرفارسي73
چکيده انگليسي84
فهرست جدول‏ها
عنوان صفحه
جدول(3-1) اجزاي تشکيل دهنده محيط بلاد آگار43
جدول(3-2) اجزاي تشکيل دهنده ي محيط BHI براث43
جدول(3-3) اجزاي تشکيل دهنده محيط مولر هينتون آگار44
جدول(3-4) اجزاي تشکيل دهنده محيط پايه قند44
جدول(3-5) مشخصات ديسک هاي آنتي بيوتيکي استفاده شده48
جدول(3-6) پرايمرهاي استفاده شده براي پيدا کردن به سويه هاي انتروکوکي مقاوم به آمينوگليکوزيدي50
جدول( 3-7)محلول کاري جهت پرايمر aac(6?)-Ie-aph(2??)-Ia51
جدول( 3-8 )محلول کاري جهت پرايمر aph(3?)-IIIa51
جدول (3-9 )محلول کاري جهت پرايمر ant(4)-?a51
جدول( 3-10) محلول کاري جهت PCR52
جدول(3-11) برنامه PCR بهينه سازي شده براي جفت پرايمر aac(6?)-Ie-aph(2??)-Ia53
جدول(3-12)برنامه PCR بهينه سازي شده براي جفت پرايمر aph(3?)-IIIa53
جدول(3-13) برنامه PCR بهينه سازي شده براي جفت پرايمر ant(4)-?a54
جدول( 3-14) اجزاي تشکيل دهنده بافر TBE54
جدول(3-15) اجزاي تشکيل دهنده ژل لودينگ بافر53
جدول( 4-1) درصد فرواني انتروکوکوس فکاليس و انتروکوکوس فاسيوم در نمونه هاي باليني60
جدول(4-2) درصدفراواني سويه هاي انتروکوک حاوي يک ژن در نمونه هاي باليني64
جدول(4-3) درصدفراواني سويه هاي انتروکوک حاوي بيش از يک ژن در نمونه هاي باليني66
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار(4-1) درصد فراواني انتروکوک هاي جداسازي شده از نمونه هاي باليني57
نمودار(4-2) نتايج حاصل از روش ديسک ديفيوژن براي تمام ايزوله هاي انتروکوکي61
فهرست شکل‏ها
عنوان صفحه
شکل( 4-1) کشت در محيط5/6 درصد BHI Broth Nacl57
شکل(4-2) کشت روي محيط بلاد آگار 58
شکل(4-3 )رنگ آميزي گرم انتروکوک و مشاهده توسط ميکروسکوپ با بزرگنمايي 100X58
شکل(4-4) محيط کشت لاکتوز59
شکل(4-5) محيط کشت آرابينوز جهت افتراق دو گونه انتروکوک59
شکل(4-6) محيط کشت آرابينوز عدم رشد باکتري انتروکوکوس فکاليس60
شکل(4-7) الکتروفورز نمونه‌هاي DNA استخراج شده با روش جوشاندن بر روي ژل آگارز 161
شکل(4-8) نتايج اندازه گيري غلظت DNA استخراجي با روش جوشاندن با دستگاه نانودراپ62
شکل(4-9) نتايج حاصل از الکتروفورز ژن aac(6?)-Ie-aph(2??)-Ia و aph(3?)-IIIa63
شکل(4-10) نتايج حاصل از الکتروفورز از ژن ant(4)-l a64
شکل(4-11) نتايج حاصل از الکتروفورز از ژن هاي مورد بررسي به روش Triplex-PCR65
چکيده
انتروکوک ها جز فلور طبيعي دستگاه گوارش انسان مي‏باشند و به عنوان يک پاتوژن فرصت طلب باعث عفونت هاي بيمارستاني به ويژه در بخش مراقبت هاي ويژه(ICU) مي گردد. اين باکتريها به طور ذاتي يا با دريافت اجزا خارج ژنتيکي از طريق پلاسميد يا بر اثر موتاسيون هاي مختلف مي توانند از خود مقاومت به آنتي بيوتيک هاي بتالاکتام و آمينوگليکوزيدها نشان دهند. در انتروکوک ها ژن هاي aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia aph(3′)-IIIa و ant(4)-?a نقش اصلي در پيدايش مقاومت نسبت به آمينوگليکوزيدها را بازي مي کنند. با توجه به اينکه در ايران ميزان فراواني ژن هاي فوق درانتروکوکوس فکاليس و فاسيوم مشخص نمي باشد اين مطالعه با هدف بررسي مقاومت دارويي و فراواني ژنهاي aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia ، ant(4)-?a ، aph(3′)-IIIa در انتروکوک هاي ايزوله شده از بيماران شهر تهران اجرا مي گردد. 350 نمونه باليني مختلف در طي سال هاي 1393-1392 از بيمارستان امام خميني ، ميلاد و بقيه ا…(عج) جمع آوري شد. تعيين هويت هر ايزوله توسط تست هاي بيوشيميايي مشخص گرديد. الگوي مقاومت دارويي با استفاده از ديسک هاي آنتي بيوتيکي جنتامايسين، استرپتومايسين و ساير آمينوگليکوزيدها از روش ديسک ديفيوژن بر اساس معيار CLSI انجام پذيرفت. پس از استخراج ژنوم از هر نمونه با استفاده از پرايمرهاي aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia و aph(3′)-IIIa و، ant(4)-?a روش Triplex-PCR انجام گرديد. از ميان 150 نمونه مورد بررسي، (58%) انتروکوکوس فکاليس و (42% ) انتروکوکوس فاسيوم گزارش شدند. نتايج حاصل از تست آنتي بيوگرام، بدين صورت بود که 38% جنتامايسين،25% استرپتومايسين، 6/57% تتراسايکلين، 75/43% اريترومايسين، 25/6% ونکومايسين، 27/15%کلرامفنيکل و 47/28% سيپروفلوکساسين مقاومت نشان دادند. حضور ژنهاي aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia ، ant(4)-?a ، aph(3′)-IIIa با مقاومت چندگانه دارويي در انتروکوک ها از نظر آماري معني دار بود. پس از انجام واکنش PCR جهت تکثير ژن هاي مذکور، مشخص شد که9/56% از نمونه ها داراي ژن aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia،22% نمونه ها داراي ژن aph(3′)-IIIa و 8/38% داراي ژن ant(4)-?a بودند که 8% از نمونه ها حامل سه ژن مقاومت گزارش شدند. نتايج اين مطالعه نشان داد که ميزان فراواني ژنهاي aac(6′)-Ie-aph(2”)-Ia ، ant(4)-?a ، aph(3′)-IIIa در سويه هاي انتروکوکوس فاسيوم و فکاليس بالا بوده لذا تشخيص سريع اين نوع مقاومت ها به روش هاي مولکولي بر پايه PCRTriplex- مي تواند راهي براي جلوگيري از گسترش عفونت هاي ناشي از اين باکتري باشد.
واژگان کليدي: انتروکوکوس فاسيوم،انتروکوکوس فکاليس، آمينوگليکوزيدها، مقاومت آنتي بيوتيکي،Triplex -PCR
فصل اول
مقدمه
1-1-بيان مسأله
انتروکوک جز فلور طبيعي دستگاه گوارش انسان مي‏باشند و به عنوان يک پاتوژن فرصت طلب باعث عفونت هاي مجاري ادراري-تناسلي، اندوکارديت، مننژيت، باکتريمي سپتي سمي، عفونت هاي زخم، عفونت هاي داخل شکمي و عفونت در نوزادان مي شود. کوکسي گرم مثبت کاتالاز منفي است که به دليل حضور آن در روده اين نام به آن اطلاق شده، داراي 19 گونه است که دو گونه مهم همزيست از انتروکوک در روده انسان (مدفوع) عبارتند از: انتروکوکوس فکاليس( ??% تا ??%) و انتروکوکوس فاسيوم( ?% تا ??%). انتروکوک‌ها، بي هوازي اختياري هستند و اسپور توليد نمي‌کنند. آن‌ها گستره بزرگي از شرايط محيطي را مانند دماي ?? تا ?? درجه سلسيوس، pH از ? تا ?? و غلظت‌هاي بالاي کلريد سديم تحمل مي کنند. بر روي آگار خوندار گوسفندي، هموليز گاما ايجاد مي‌کنند. يکي از مقاوم ترين باکتري ها در برابر آنتي بيوتيک هاهستند. انتروکوک- ها به طور ذاتي يا با دريافت اجزا خارج ژنتيکي از طريق پلاسميد يا بر اثر موتاسيون هاي مختلف مي توانند از خود مقاومت به آنتي بيوتيک هاي بتالاکتام (پني سيلين، سفالوسپورين‌ها و کارباپنم) و آمينوگليکوزيدها نشان دهند در دو دهه گذشته، سويه‌هاي انتروکوکي مقاوم به ونکومايسين (1VRE) در بيماران بستري در بيمارستان‌ها افزايش يافته‌اند. سيتوليزين انتروکوکوس فکاليس به همراه مقاومت بالا به آنتي بيوتيکي جنتامايسين موجب افزايش ? برابري ميزان مرگ و مير بيماران مبتلا به باکتريمي مي شود. ژن هاي رمزگذار AMEs که سبب HLGR2 (مقاومت بالا به جنتامايسين) مي شوند، شامل چندين ژن است که توسط پلاسميد و ترانسپوزون انتقال مي يابد، در انتروکوک ها ژن aac(6?)-Ie-aph(2??)-Ia نقش اصلي در پيدايش مقاومت نسبت به جنتامايسين بازي مي کند و يک آنزيم تغييردهنده آمينوگليکوزيد ها که با دو عملکرد (استيل ترانسفراز و فسفوترانسفراز) کد مي‏کند، باعث مقاومت به همه ي آمينوگليکوزيدهاي مورد استفاده باليني به جز استرپتومايسين ها مي‏شود. در سال هاي اخير دو ژن مقاومت aph(3?)-IIIa و ant(4)-?a شناسايي شد که به طور ذاتي انتروکوک داراي اين دو ژن مي باشد که در برابر آنتي بيوتيک هاي آمينوگليکوزيدي به خصوص استرپتومايسين ها و به جز جنتامايسين ايجاد مقاومت در باکتري مي کنند. با توجه به اينکه در ايران ميزان فراواني ژن هاي فوق درانتروکوکوس فکاليس و فاسيوم مشخص نمي باشد اين مطالعه با هدف بررسي مقاومت دارويي و فراواني ژنهاي aac(6?)-Ie-aph(2??)-Ia ، ant(4)-?a ، aph(3?)-IIIaدر انتروکوک هاي ايزوله شده از بيماران شهر تهران اجرا گرديد.
1-2-ضرورت انجام تحقيق
با توجه به اينکه انتروکوک ها يکي از عوامل اصلي ايجاد کننده عفونت هاي بيمارستاني مي باشند و با توجه به افزايش مقاومت روز افزون اين ارگانيسم ها به انواع آنتي بيوتيک ها به خصوص ونکومايسين و آمينوگليکوزيدها ( داروهاي انتخابي جهت درمان عفونت هاي ناشي از آنها)، در اين پژوهش به بررسي ژن هاي عامل مقاومت به آمينوگليکوزيدها به روش 3Triplex-PCR پرداخته شد تا راه حلي مناسب براي کنترل عفونت و پيشگيري از آن ارائه گردد.
1-3-اهداف تحقيق
* تعيين ميزان مقاومت آنتي بيوتيکي در انتروکوکوس فکاليس و انتروکوکوس فاسيوم به روش ديسک ديفيوژن.
* جداسازي ژن aac(6?)-Ie-aph(2??)-Ia در انتروکوکوس فکاليس و انتروکوکوس فاسيوم به روش PCR.
* جداسازي ژن ant(4)-?a در انتروکوکوس فکاليس و انتروکوکوس فاسيوم به روش PCR.
* جداسازي ژن aph(3?)-IIIa در انتروکوکوس فکاليس و انتروکوکوس فاسيوم به روش PCR.
* جداسازي همزمان ژن هاي aac(6?)-Ie-aph(2??)-Ia ، ant(4)-?a ،aph(3?)-IIIa در انتروکوکوس فکاليس و انتروکوکوس فاسيوم به روش Triplex-PCR.
1-4-فرضيه ها
1) ژن هاي عامل مقاومت افزايش يافته به آمينوگليکوزيدها aac(6?)-Ie-aph(2??)-Ia ، ant(4)-?a ،aph(3?)-IIIa در انتروکوک هاي ايزوله شده از بيماران وجود دارند.
2) ژن هاي عامل مقاومت افزايش يافته به آمينوگليکوزيدها aac(6?)-Ie-aph(2??)-Ia ، ant(4)-?a ،aph(3?)-IIIa در انتروکوک هاي ايزوله شده از بيماران وجود ندارند.
1-5-تعريف واژه ها
انتروکوکوس فاسيوم: باکتري گرم مثبت و کوکسي شکل است که به عنوان يک پاتوژن فرصت طلب باعث عفونت هاي نظير مجاري ادراري-تناسلي مي شود.
انتروکوکوس فکاليس: کوکسي گرم مثبت که به صورت پاتوژن فرصت طلب عامل عفونت هاي جدي نظير عفونت هاي مجاري ادراري-تناسلي وباکتريمي در بخش هاي مختلف بيمارستان به ويژه ICU مي شود.
تريپلکس – پي سي آر(Triplex-PCR): روش مولکولي براي جداسازي سه ژن به صورت همزمان است.
MIC: حداقل غلظت آنتي بيوتيکي براي جلوگيري از رشد باکتري
PCR: واکنش زنجيره اي پلي مراز که شامل مراحل زير است:
1. Denaturation: دمايي که دو رشته ي DNA از هم جدا مي شوند.
2. Anneling: دمايي که پرايمر طراحي شده با تک رشته DNA جفت مي شود.
3. Extention: دمايي که در آن پليمرازسيون با آنزيم DNA پليمراز انجام مي گيرد.
فصل دوم
مروري بر تحقيقات انجام شده
2-1-تاريخچه باکتري انتروکوک
در سال 1899 تي يرسيلين واژه انتروکوک را براي بيان توصيف ارگانيسم هاي کوچک جفت يا تک زنجيره اي کوتاه که در مدفوع ديده شدند، انتخاب کرد. مشاهداتي در مورد خصوصيات رنگ آميزي گرم، آرايش سلولي، شکل و فقدان کاتالاز، انتروکوک ها را به عنوان اعضا جنس استرپتوکوک معرفي نمود.
درسال 1933 با توجه به سيستم گروه بندي لانسفيلد، انتروکوک ها از لحاظ آنتي ژن اختصاصي در گروهD قرار دارند(روف4 ،1990 ). ربکا لانسفيلددر رده بندي پيشنهادي خود، دريافت که اگراسترپتوکوک را در محيط کشت مايع با2=pH قرار دهد و به مدت 10 دقيقه در گرماي 100 درجه سلسيوس نگه داري کند، ماده- ي آنتي ژني محلولي از جنس هيدرات کربن از ديواره ي باکتري خارج مي شود که آن را کربوهيدرات C ناميد و آنتي ژن آن را به گروه هاي A تاE تقسيم بندي کرد. تمام اعضاي جنس انتروکوک با آنتي سرم گروه D لانسفيلد واکنش مي دهند (کاروالهومدا و همکاران5، 2000؛ فاکلم6، 2002).
درسال هاي بعد با به کارگيري تکنيک هاي جديد طبقه بندي، نظير دورگه سازي DNA، جنس استرپتوکوکوس به سه گروه تقسيم گرديد:
1) جنس استرپتوکوکوس که تعداد وسيعي از گونه ها شامل استرپتوکوک هاي پيوژنيک، استرپتوکوک هاي ويريدانس و پنوموکوک را در بر مي گيرد.
2) جنس انتروکوک شامل انتروکوک هاي گروه D يا استرپتوکوک هاي مدفوعي.
3) جنس لاکتوکوک يا استرپتوکوک هاي اسيدلاکتيک که حاوي آنتي ژن N لانسفيلد هستند.(روف، 1990؛ کنمان و همکاران7، 1992)
نام انتروکوکوس(8E) فکاليس توسط اندرووهوردر در سال 1906 براي ارگانيسم هايي با منشا مدفوعي که توانايي انعقاد شير،عدم توانايي تخمير رافينوز،تخمير مانيتول و لاکتوزرا داشت،به کاربرده شد. (فاکلم،2002). جنسون، انتروکوکوس فاسيوم را متمايز از انتروکوکوس فکاليس از نظر الگوي تخميري شرح داد.
ووينگ،استرپتوکوکوس دورانس را با فعاليت تخميري کمتري نسبت به استرپتوکوکوس فاسيوم معرفي کرد.(موالرينگ و گيلمور9،2007؛ اومباندانزا موسا و همکاران10، 2002).
در سال 1984 جنس انتروکوکوس نخستين بار توسط چليپر و کليفرا از استرپتوکوک ها جدا شد.جنس انتروکوک فقط داراي آنتي ژن D است که جز فلور نرمال دستگاه گوارش انسان مي باشد.گونه هاي ديگري که داراي آنتي ژن گروهD مي باشند قسمتي ار فلورنرمال روده را تشکيل مي دهند.(لي،1972؛ ام سي بريد و همکاران11، 2007).
امروزه اين جنس، گونه هاي مختلفي را در خود جاي مي دهد که تعداد آن ها در منابع مختلف از 17 تا 21 گونه متغير بوده(فاکلام،2002؛ گارماشوا و کووالنکو12،2010) و در 5 گروه اصلي قرار مي گيرند(گارماشوا و کوالنکو،2010).دو گونه شايع آن ها انتروکوکوس فکاليس و انتروکوکوس فاسيوم مي باشد اما گزارش هايي به ندرت مبني بر مشـــــاهده ساير گــــونه ها در عفونت هاي انساني ديده شده است که از انواع آن مي توان به
E.durans, E.avium, E.gallinarum, E.munstii, E. flavescens, E.hirae, E. raffinosus, E. casseliflavus اشاره نمود (کوالنکو،2010؛ وينست و همکاران13،1992؛ کاروالهو و همکارانش، 2000؛ گارماشوا، 2004). در مناطق مختلف دنيا حضور اين گونه ها، متفاوت بوده است و در مواردي دو گــــــــونه
E. casseliflavus و gallinarrum .E بيشترين گونه پس از E. faecuim و E. faecalis گزارش شده است (فرانز و همکاران14، 1999).
2-2-تاکسونومي
براساس توالي SrRNA 16 گونه هاي انتروکوک در چندين گروه قرار گرفته اند.(کاردن و سالمن ليلجا15،2013، ريو و همکاران16، 2013).
1.گروه انتروکوکوس فکاليس :شامل انتروکوک هاي فکاليس، هموپراکسيداز و موراونسيس
2.گروه انتروکوکوس فاسيوم: شامل انتروکوک هاي فاسيوم، دورانس،هيره،موندتي،پورکينز و ويلوروم
3.گروه انتروکوکوس آويوم: شامل انتروکوک هاي آويوم،پسودوواريوم،مالودوراتوس و رافينوزوس
4.گروه انتروکوکوس کاسلي فلاووس:شامل انتروکوک هاي کاسلي فلاووس، گاليناروم،فلاووس
5.گروه انتروکوکوس سکوروم:شامل انتروکوک هاي سکوروم و کلومبا
6.گروه انتروکوکوس ديسپار: شامل انتروکوک هاي ديسپار و اسيني
7.گروه ساکاروليتيکوس :شامل انتروکوک هاي ساکاروليتيکوس و سولفوروس
گروه اول قادر به توليد اسيد در محيط مانيتول براث و هيدروليز آرژينين داشته اما سوربوز منفي مي باشند. انتروکوکوس فکاليس در اين دسته قرار مي گيرد. اين گونه مسئول 90-85% عفونت هاي انتروکوکي انسان است. علاوه بر روده ي انسان، در دستگاه گوارش گوساله، مرغ، اسب، گوسفند، خوک نيز يافت مي شود.منفي بودن تست آرابينوز وجه تمايز گروه اول با ديگر اعضاي گروه دوم است. تعدادي از واريانت هاقادر به تحمل تلوريت و استفاده از پيرووات مي باشند.
گروه دوم قادر به توليد اسيد در محيط مانيتول و سوربوزبراث را داشته، ولي قادر به هيدروليز آرژينين نمي‏باشد.
گروه سوم توانايي تشکيل اسيد را در محيط مانيتول براث و سوربوز اسيد ندارد، ولي آرژينين را هيدروليز مي‏کنند. واريانت هاي مانيتول منفي وانتروکوکوس فکاليس در اين گروه قرار دارند. درواريانت هاي غير شايع انتروکوکوس فکاليس که مانيتول منفي و پيرووات مثبت مي باشند، آرابينوز، رافينوز و سوکروز منفي مي باشد. انتروکوکوس فاسيوم مانيتول منفي نيز تنها عضو اين گروه است که قادر به استفاده از آرابينوز مي باشد.
گروه چهارم از سه گونه تشکيل شده که از نظر تشکيل اسيد در محيط حاوي سوربوز و مانيتول براث مثبت بوده و هيدروليز آرژينين آن منفي مي‏باشد. هيچ‏کدام از گونه‏هاي انتروکوکوس فکاليس در اين گروه قرار ندارد.
گروه پنجم، شامل گونه هاي انتروکوکوس گاليناروم، انتروکوکوس کاسلي فلاووس، انتروکوکوس کولومبا و انتروکوکوس فکاليس هستند. البته انتروکوکوس کولومبا مشابه واريارانت هاي آرژينين منفي و انتروکوکوس فکاليس مي‏باشد و با تشکيل اسيد در محيط رافينوز براث از انتروکوکوس فکاليس متمايز مي‏شوند.
2-3-فاکتورهاي بيماري زايي
انتروکوک ها به علت مقاومت آنتي بيوتيکي به عنوان يکي از مهم ترين عفونت هاي بيمارستاني به شمار مي‏آيند که اين مقاومت در کنار فاکتورهاي ويرولانس ذاتي، با هم به صورت مستقل در ايجاد بيماري نقش دارند(جت و همکاران17،1994). مي توان گفت حضور همين فاکتورهاي ويرولانس است، که با وجود حساسيت بيشتر انتروکوکوس فکاليس در مقايسه با انتروکوکوس فاسيوم نسبت به آنتي بيوتيک ها، آن ها را به گونه غالب در ايجاد عفونت هاي انتروکوکي تبديل کرده است( جوهانسون و راسموسن18، 2013) انتروکوکوس فکاليس داراي فاکتورهاي ويرولانس متعددي همچون سيتوليزين، محصولات سوپر اکسيد خارج سلولي، انتقال پلاسميد هاي حساس به فرمون و يک پروتئين سطحي متصل شونده، از انواع پروتئين سطحي انتروکوکي(ESP19) که به تازگي شناسايي شده و به منظور کلنيزه نمودن موفقيت آميز بيماران ضروري مي باشند، تقريبا مي توان گفت تنها ويژگي هاي انتروکوکوس فکاليس ESP، سيتوليزين و مواد تجمعي مي باشد(جوهانسون و راسموسن، 2013).
2-3-1-مواد تجمعي
در پاسخ به فرمون هاي توليد شده توسط ساير انتروکوک ها، سويه هاي خاصي از انتروکوک ها فرمون سرم ايجاد مي کنند. مواد تجمعي سبب اتصال اين ارگانيسم ها به سلول هاي توبولاري کليوي شده و در گسترش عفونت ادراري نقش مهمي بازي مي کنند(موالرينگ20،1992)، همين طور سبب اتصال سلول باکتري دهنده و گيرنده براي انتقال پلاسميد مي گردند(فلاناگان و همکاران21،2008). به علاوه اين مواد در زنده ماندن انتروکوکوس فکاليس در پلي مورفونوکلئوها به دنبال فاگوسيتوز نقش دارند(داو و همکاران22،2012) و موجب وارد شدن انتروکوک ها از طريق سلول هاي اپي تليال روده مي شود.(استک و همکاران23،2011). مواد تجمعي و سيتوليزين به طور سينرژيسم از طريق کوآروم سنسينگ با تنظيم ترشح سيتوليزين منجر به آسيب وسيع بافتي بيماران مبتلا به اندوکارديت مي گردند.
2-3-2-سيتوليزين
حضور سيتوليزين در 60% سويه هاي انتروکوکوس فکاليس به صورت ليز گلبول هاي قرمز در محيط کشت مشاهده شده است.اين فاکتور مي تواند از طريق پلاسميدها کونجوگه به باکتري هاي ديگري منتقل مي‏گردد(کوبرن و گيلمور24،2003).
آزمايش ها نشان مي دهد که وجود اين فاکتور ويرولانس در سويه هاي مولد باکتريمي، سبب افزايش مرگ و مير تا 5 برابر مي گردد(کوبرن و گيلمور،2003). از سيتوليزين انتروکوکوس فکاليس، به عنوان يک توکسين منحصر به فرد باکتريايي ياد مي گردد( ون و همکاران25، 2013).قبلا نيز اشاره نموديم که حضور هموليزين در سويه هاي با مقاومت به سطح بالاي جنتامايسين(HLGR)، وضيعت بيماررا حادتر مي کند(ارلندسن و ولز26،1994). به عنوان مثال در دهه ي 1980 آزموني توسط هوک و همکارانش انجام شد، معلوم گرديد که ميزان خطر در اين سويه ها 5 برابر سويه هاي فاقد هموليزين است. پس از آن کابالرو و همکاران دريافتند که حساسيت يا مقاومت اين سويه ها به جنتامايسين تاثيري در شدت بيماريزايي ندارند و اين فاکتور هموليزين است که در افزايش بيماريزايي نقش دارد (کابالرو گرانادو و همکاران27،1998).

2-3-3-ژلاتيناز
يکي ديگر از انواع فاکتورهاي ترشحي،ژلاتيناز مي باشد که نقش مهمي در بيماريزايي و ايجاد عفونت ها و بيماري هاي انتروکوکي دارد(ورجيس و همکاران28،2002). در سال 1988 دوپونت29 و همکارانش طي مطالعاتي، نشان دادند که ژلاتيناز و توليد آن در سويه هاي انتروکوکي باعث کاهش مقدار50LD براي موش هاي آزمايشگاهي مي گردد. نتايج نشان مي دهد انتروکوک هاي جدا شده از مدفوع بيماران و سويه هاي مولد اندوکارديت به ترتيب 27% و 50% داراي اين فاکتور بيماريزا مي باشند (موهلر و کاربن، 1998).

2-3-4-فرمون
درواقع فرمون ها پپتيدهاي کوچکي هستند (8-7 اسيدآمينه) که از طريق لقاح30 توسط انتروکوکوس فکاليس براي افزايش انتقال پلاسميد در بين سويه ها ترشح مي گردند. اين پپتيد ها از طريق کروموزوم کد مي شوند. هر پلاسميد پاسخ دهنده به فرمون مي تواند يک پپتيد ترشحي را نيز کد کند که به عنوان يک مهارکننده رقابتي براي فرمون در نظر گرفته مي شود(ان و کلول31،2002). مطالعات اخير نشان داده است که برخي از فرمون ها به عنوان مهار کننده هاي خودشان عمل مي کنند. اغلب اين مهار کنندگان جذب شيميايي نوتروفيل ها همراه با ترشح آنزيم هاي گرانولي و القاء انفجار تنفسي هستند(فلانگان و ان32، 2002).

2-3-5-ليپوتيکوئيک اسيد
يکي ديگر از فاکتورهاي موثر در ايجاد بيماري اين گونه از باکتري ها ليپوتيکوئيک اسيد مي باشد که خصوصيات بيولوژيکي متعددي براي آنها شناسايي شده است. در واقع مشخص شده است که اسيد ليپوتيکوئيک به طور قابل برگشتي به اريتروسيت هاي انساني متصل مي شود و مشخص شده است که آزاد- سازي اينترلوکين شش و ?-TNF را از مونوسيت هاي انساني القا مي نمايد(وندلبو و پائولسن33، 2004).
2-3-6-هموليزين انتروکوکوس فکاليس
تحقيقات نشان داه است درصد زيادي از ايزوله هاي کلينيکي انتروکوکوس فکاليس داراي اين فاکتور هستند که قادر به توليد هموليزين به عنوان يک پروتئين سيتوليتيک مي باشند. اريتروسيت هاي انسان، خرگوش و اسب را هيدروليز کرده ولي روي اريتروسيت هاي گوسفند تاثيري ندارند(فيفادارا و همکاران34،2003، رودريگوس و تورس35،2006). سيتوليزين معمولا توسط پلاسميدهاي قابل انتقال کد مي گردد، ولي گاهي ژن هاي سيتوليزين در عناصر کروموزومي نيز ديده مي شوند(فيفادارا و همکاران، 2003).
پلاسميد کد کننده هموليزين PADa نام دارد. هموليزين انتروکوک ها خاصيت باکتريوسيني داشته و به ميزان وسيعي گونه هاي باکتريايي گرم مثبت را مهار مي کند. فرم فعال سيتوليزين تشکيل شده از دو زيرواحد پپتيدي غير مشابه که هردوي آن ها جهت فعاليت هموليتيک وباکتريسيدال ضروري مي باشند(پترسن و همکاران36، 2012).

2-3-7-آنتي ژن اندوکارديتي انتروکوکوس فکاليس
آنتي ژن 73 کيلودالتوني است که در سويه هاي انتروکوکوس فکاليس عامل ايجاد اندوکارديت مي باشد. ازپروب جهت شناسايي گونه هاي انتروکوکوس فکاليس استفاده مي کنند(موراي37،1997). با اين حال نقش دقيق اين آنتي ژن در بيماريزايي عفونت هاي انتروکوکوس هنوز مشخص نشده است( پريتي و همکاران38، 2010).
2-3-8-پروتئين سطحي انتروکوکي (ESP39)
ژن ESP و اپرون سيتوليزين بر روي کروموزومي به طول 150 کيلوبازي قرار دارند که مشابه به جزاير پاتوژنسيته باکتري هاي گرم منفي است. پروتئين ESP به عنوان ادهسين انتروکوکوس فکاليس در کلنيزاسيون دستگاه ادراري و تشکيل بيوفيلم نقش دارد( شانکر و همکاران40،2001). ژن ESP از 41درصد انتروکوکوس فکاليس ها با منشا خوني، 42 درصد اندوکارديت و 3 درصد مدفوع جدا شده است(ليندال و گيلمور41،1999).

2-3-9-ادهسين کلاژن انتروکوکوس فکاليس (ACE42)
ادهسين يک کلاژن باند شونده در سويه هاي انتروکوکوس فکاليس بيماريزا و همزيست مي باشد. اين پروتئين در طي عفونت انساني در انتروکوک بيان مي گردد. توسط اين مولکول چسبنده سويه هاي انتروکوکوس فکاليس به کلاژن تيپ 1و4، لامينين و ويترونکتين متصل مي گردند. اين ادهسين متشکل از يک سکانس N ترمينال با 31 اسيدآمينه، بخش a با 335 اسيد آمينه، بخش b از واحدهاي تکراري 47 اسيدآمينه اي و بخش غني از پرولين متصل به ديواره سلولي و ناحيه 8 آمينواسيدي متصل به غشا سيتوپلاسمي در بخش انتهاي کربوکسيل قرار دارد(ارتن و ارستاويک43، 2005).

2-4-بيماري زايي
براي ايجاد عفونت، انتروکوک ها بايد قادر به کلنيزاسيون در سطوح مخاطي را داشته باشند تا بتوانند به سيستم دفاعي ميزبان آسيب برسانندو باتوليد تغييرات پاتولوژي در ميزبان عفونت را به وجود آورند،در نتيجه انتروکوک ها به طور نرمال در دستگاه گوارشي انسان کلنيزه مي شوند و حرکات طبيعي دستگاه گوارش رااز بين مي برند. در ادامه برخي از عفونت هاي شايع که توسط انتروکوک ها ايجاد مي‏شود، بيان مي‏گردد.

2-4-1-باکتريمي
8 درصد از موارد باکتريمي توسط انتروکوک ها ايجاد مي شود که به عنوان سومين عامل باکتريمي عفونت هاي بيمارستاني شناخته شده اند. انتروکوک ها به اپي تليال دستگاه گوارشي انتقال پيدا مي کنندومنجر به باکتريمي مي شود. عفونت هاي هموليتيک وعفونت هاي با سويه هاي انتروکوکوس فاسيوم مقاوم به جنتامايسين مرگ- وميري بيش از 5برابر نسبت به سويه هاي غير هموليتيک وحساس به جنتامايسين دارند. (ورهوف و اسچميز44،2003؛ تافين و همکاران45، 2011؛ لازراک و همکاران46، 1990؛ کيو و همکارن47، 2006).
2-4-2-عفونت هاي مجاري ادراري
از مجموع عفونت هاي اکتسابي بيمارستاني 30 تا40 درصد عفونت هاي مجاري ادراري ناشي ازانتروکوک ها مي باشد وبعد ازاشريشياکلي به عنوان دومين عامل ايجاد عفونت دستگاه ادراري مورد اهميت قرار مي‏گيرد. علت عفونت هاي اکتسابي در بيمارستان توسط اين باکتري ناشي از قرار گرفتن سوند دردستگاه ادراري-تناسلي واقامت طولاني مي باشد(ميسکين و دودهار48، 2002). انتروکوک ها عامل شايع پروستاتيک ،اپيديديميت و سيستيت درافراد مسن مي باشند که در نهايت عفونت هاي دستگاه ادراري فوقاني مي تواند منجر به باکتريمي گردد، اين باکتري دربرابر بسياري از آنتي بيوتيک ها مقاوم هستند(ويت وهمکاران49، 2012). انتروکوک ها به خصوص انتروکوک هاي مقاوم در برابر ونکومايسين (VRE ) بيماريزاي عمده دستگاه ادراري مي باشند.
فرچون و همکاران(2002) طي مطالعاتي رابطه اي بين اتصال انتروکوک ها به سلول هاي اپي تليال دستگاه ادراري وسويه هاي داراي پلاسميد را نشان دادند، در واقع انترکوکوس فکاليس پلاسميد حساس به فرمون به نام PAD و يا مشابه آن را توليد مي کند که قادر به اتصال به لايه سلولي مجاري کليوي هستند.

2-4-3-اندوکارديت
مي توان گفت سومين عامل اندوکارديت انتروکوک ها مي باشندکه حدود30-20درصدموارد اندوکارديت را تشکيل مي دهند . اين بيماري در افراد با ضايعات دريچه اي قلب وافراد مسن وحتي بيماراني که تحت عمل جراحي دستگاه گوارش و يا ادراري _تناسلي قرارمي گيرند مشهود است. وجود پلاسميد پاسخ دهنده به فرمون PAD در انتروکوک هاباعث افزايش تشکيل اندوکارديت انتروکوکي مي شود( ام سي دونالد و همکاران50،2005).
2-4-4-عفونت هاي داخل شکمي، لگني وبافت هاي نرم
در 58 تا 59 درصد از آبسه هاي ايجاد شده، انتروکوک ها همراه با باکتريهاي بي هوازي نظير باکتريوئيدس فراژيليس و فوزوباکتريوم واريوم نقش بسزايي دارند. عده اي معتقدند که انتروکوک ها فقط در همراهي با باکتري ها بي هوازي بيماريزا هستند . به دنبال زخم هاي لگني ،آبسه هاو عفونت هاي داخل شکمي انتروکوک- ها دومين عامل ايجاد کننده باکتريمي به شمار مي آيند .انتروکوک ها از15%موارد زخم هاي عفوني جدا شده اند ، ولي به ندرت از ضايعات زخم هاي پا،زخم هاي جراحي بيماران بستري درICU زخم هاي بستر و استئوميليت در افراد ديابتي جدا گرديده اند(گرنينجر و راجت51 ، 1992).
2-4-5-ساير عفونت هاي انتروکوکي
از عوامل نادر مننژيت در افراد سالم مي توان به انتروکوک ها اشاره کرد. نوزادان وافرادي که جراحي هاي دستگاه عصبي داشته اند ويا دچار نقص سيستم عصبي مرکزي بوده اند ممکن است به مننژيت انتروکوکي مبتلا شوند. عفونت دستگاه ادراري ويا اندوکارديت ايجاد شده توسط انتروکوک به عنوان عوامل زمينه ساز ابتلا به مننژيت مطرح شده اند(جاسپن و همکاران،2010).
2-5-شناسايي انتروکوک‏ها
انتروکوک ها کوکسي هاي گرم مثبت بي هوازي اختياري و کاتالاز منفي هستند که قادرند در محيط‏هاي حاوي40% صفراو5/6% کلريدسديم رشد کنند. رشد آن ها معمولا در pH محدوده (6 الي 9) و در دماي 45-10 درجه سلسيوس مشاهده شده است. انتروکوک ها در 60درجه سلسيوس،30 دقيقه زنده مي مانند و رشد بهينه آن ها در37 درجه سلسيوس مي باشد. اغلب اين باکتري ها قادر به هيدروليز پيروات مي باشند(گروبنر و اسچولته52،2012).آن ها بر روي محيط بلاد آگار(53BA) به راحتي رشد مي کنند و غالبا قادر به ليز گلبول قرمز نمي باشند(هموليز?) اما انواع آلفا (à) و بتا (?) نيز در ميان آن ها مشاهده مي گردد. به طوري که نوع ? در ميان 10 گونه از انواع انتروکوک ها ديده مي شود. اين باکتري ها قادرند به راحتي شرايط سخت محيطي را تحمل کنند(فرتالي و فاکلام،1987). لذا هرجايي در طبيعت،از جمله خاک،آب،حيوانات،حشرات و پرندگان قابل جداسازي هستند(موريس و همکاران54، 2012). انتروکوک ها دامنه ي وسيعي از کربوهيدرات هارا تخمير مي کند که محصول نهايي بدون توليد هيچ گازي،اسيدلاکتيک است.


دیدگاهتان را بنویسید