1-6-1 نوروسفر25
1-6-1-1 نوروسفر منبعي براي سلول درماني31
1-7 ضرورت اهداف تحقيق33
فصل دوم: مواد و روشها35
2-2 تهيه و نگهداري حيوان آزمايشگاهي36
2-2 جداسازي و کشت سلولهاي بنيادي مغز استخوان موش صحرايي بالغ36
2-2-1 طرز تهيه محيط کشت ?-MEM36

2-2-2 طرز تهيهPBS فاقد كلسيم و منيزيم (2/7 : PH)37
2-2-3 طرز تهيه تريپسين/ EDTA37
2-2-4 روش جداسازي و کشت سلولهاي بنيادي مغز استخوان39
2-2-5 پاساژ سلولي39
2-3 تأييد هويت سلول‌هاي استرومايي به روش ايمونوسيتوشيمي39
2-3-1 ايمونوسيتوشيمي CD7140
2-3-1-1 طرز تهيه پارافرمالدئيد 4%41
2-3-1-2 طرز تهيه ژلاتين 1/0 درصد41
2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%41
2-3-1-4 طرز تهيه PBS ايمنوسيتوشيمي (4/7 – 2/7 = PH)42
2-3-1-5 طرز تهيه بافر گليسرول42
2-3-2 رنگ آميزي آلکالين فسفاتاز43
2-4بررسي مارکر عصبي ?III-tubulin در سلول‌هاي مزانشيمي مغز استخوان به روش ايمونوسيتوشيمي44
2-5 تاييد هويت عصبي نوروسفرها به روش ايمونوسيتوشيمي45
2-6 بررسي مولكولي بيان ژنهاي اعضاي خانواده نوروتروفين46
2-6-1 استخراج RNA كل از سلول‌هاي كشت شده46
2-6-2بررسي کمي و کيفي RNA استخراج شده48
2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز49
2-6-4 واکنش ساخت cDNA (واکنش رونويسي معکوسRT-)52
2-6-5 انتخاب پرايمر53
2-6-6 آماده‌سازي پرايمرها54
2-6-7 واكنش PCR54
2-7 آناليز آماري58
فصل سوم: نتايج59
3-1 مشاهده مورفولوژي سلول‌هاي مزانشيمي مغز استخوان در شرايط کشت با ميکروسکوپ اينورت59
3-2 تعيين هويت سلول‌هاي مزانشيمي مغز استخوان با نشانگر CD71 و آلکالين فسفاتاز60
3-3 ويژگيهاي مورفولوژيکي سلول‌هاي مزانشيمي مغز استخوان بعد از کشت طولاني مدت60
3-4 تأييد هويت سلول‌هاي عصبي با استفاده از روش ايمونوسيتوشيمي60
3-5 تأييد هويت نوروسفرها با استفاده از نشانگر نستين61
3-6 ارزيابي بيان ژنهاي فاكتورهاي نوروتروفيك و مارکرهاي نوروني و بررسي آماري شدت باندها و نمودارهاي مربوط به آن 61
4-1 نتيجهگيري و بحث 70
4-1 مورفولوژي سلولهاي بنيادي مزانشيمي در کشت طولاني مدت و تاييد هويت آنها71
4-2 بيان فاکتورهاي رشد عصبي به وسيله سلولهاي بنيادي مزانشيمي72
4-3 پتانسيل تمايز سلولهاي بنيادي مغز استخوان به سلولهاي عصبي74
4-4 توليد نوروسفر از سلولهاي بنيادي مغز استخوان در كشت طولاني مدت76
4-5 نتيجه گيري77
پيشنهادات77
مراجع79
فهرست شکلها

شکل 1-1. مسيرهاي پيام رساني که با واسطه P75NTR تنظيم ميشود..22
شکل 1-2. نوروتروفينها و گيرندههاي مربوط با آن:رسپتور تيروزين کيناز و P75NTR.23
شکل 1-3. مسيرهاي سيگنالينگ که با واسطه Trk تنظيم ميشود.24
شکل 1-4. سلولهاي بنيادي عصبي و ردههاي سلولي مربوط به آن..25
شکل 1-5 .ارزيابي شکلگيري نوروسفر26
شكل 1. تصاوير فاز كنتراست سلولهاي استرومايي مغز استخوان موش صحرايي در محيط كشت در پاساژهاي مختلف.62
شكل 2. شناسايي سلولهاي استرومايي مغز استخوان موش صحرايي63
شکل 3. تصوير فاز کنتراست از MSCs در پاساژ پنجم بعد از دو هفته 64
شکل 3. تصوير فاز کنتراست از پاساژ پنجم MSCs پس از هفته سوم65
شکل4 تأييد هويت سلول‌هاي عصبي با استفاده از روش ايمونوسيتوشيمي 66
شکل 5 تأييد هويت نوروسفرها با استفاده از نشانگر نستين 66
شكل6 A.الگوي بيان ژن فاکتورهاي نوروتروفيک در پاساژ پنجم سلولهاي بنيادي مزانشيمي (گروه کنترل) و B: گروه آزمايشي (کشت طولاني مدت).67
شكل 6. C الگوي بيان ژن پيشساز عصبي و ژنهاي اختصاصي سلولهاي دوپامينرژيک در پاساژ پنجم سلولهاي بنيادي مزانشيمي (گروه کنترل) و D. گروه آزمايشي (کشت طولاني مدت). 67
نمودار 6 A. مقايسه ميزان بيان نسبي ژنهاي فاکتورهاي نوروتروفيک در گروه آزمايشي و کنترل..68
نمودار6 B.مقايسه ميزان بيان نسبي ژنهاي نوروني در گروه آزمايشي و کنترل..69
فهرست جدولها
جدول1-1 . اسامي گوناگون سلولهاي بنيادي مزانشيمي6
جدول1-2 اطلاعات مربوط به پرايمرها، F : پرايمر بالادست ، R : پرايمر پايين‌دست57
فصل اول
مقدمه و مروري بر مطالعات گذشته

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

فصل اول
مقدمه و مروري بر مطالعات گذشته

مقدمه
امروزه تحقيق بر روي سلولهاي بنيادي به دانش پيشرفتهاي تبديل شده است که نه تنها در حيات علمي، بلکه در بعد اقتصادي نيز موثر قلمداد ميشود ]1[. سالهاست که اين تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسيم سلولي آيا ميتوان درمان را بر پايه اين سلولها بنا نهاد. اين تفکر و تحقيق به تدريج به طرف طب جديدي سوق داده ميشود که از آن به عنوان reparative (regenerative) medicine نام برده ميشود] 2[. پر واضح است براي رسيدن به اين هدف، درک کامل بيولوژي سلولي و ماهيت سلولهاي بنيادي از اهميت ويژهاي برخوردار است. خصوصا” عليرغم تحقيقات وسيع، هنوز ابهامات متعددي پيرامون نحوه عملکرد سلولهاي بنيادي وجود دارد ]3[.
سلولهاي بنيادي، سلولهاي زاياي1 غير بالغاند که قادر به خود تکثيري (Self-renewal) هستند و از اين طريق جمعيت سلولي خود را حفظ ميکنند]4[. هر سلول بنيادي در کنام يا نيچ2 تنظيمي خود قرار گرفته است. کنام يک سلول، مجموعهاي از عوامل فيزيکي و شيميايي است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلولهاي بنيادي، تنظيم توازن بين خود نوزايي و تمايز است. يکي از مکانيسمهاي تنظيم کننده اين توازن کنترل تقسيم متقارن3 و نامتقارن4 ميباشد. در تقسيم نامتقارن، از تقسيم سلول بنيادي دو سلول دختري ايجاد ميگردد که يکي در کنام باقي مانده و ديگري کنام را ترک کرده تا تعداد زيادي پيش ساز ايجاد نمايد و در نهايت به سلولهاي بالغ تمايز پيدا ميکنند. در عوض در تقسيم متقارن، دو سلولدختري ايجاد ميگردد که هر دو در کنام باقي مانده و به صورت بنيادي باقي ميمانند] 5، 6[. بنابراين سلولهاي بنيادي، سلولهاي تمايز نيافتهاي ميباشند که توانايي خود تکثيري، توليد نسل تمايز يافته عملکردي و ترميم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.
سلولهاي بنيادي بر اساس قابليت تمايز به سه گروه تقسيم ميشوند:
همه توان5: جزء اولين سلولهايي هستند که در جنين شکل ميگيرند ( از تخمک لقاح يافته 1-3 روزه)، قابليت تمايز به انواع سلولهاي ارگانيسم را دارند] 4[.
پر توان6: از توده سلولي داخلي7 در مرحله بلاستوسيست 100تا 200 سلولي منشاء ميگيرند. اين سلولها داراي توانايي تمايز و تکثير نامحدود هستند و قادرند به هر سه لايه سلولي تمايز يابند]7[.
چند توان8: اين گروه را سلولهاي بنيادي بالغ9 و يا سلولهاي بنيادي سوماتيك نيز مي‌نامند که بصورت خاموش و غير متعهد حفظ ميشوند تا در آينده و بر اساس نياز فعال شده و به ساير دودمانهاي مربوط به همان بافت تمايز يابند]8[، به عنوان مثال سلولهاي بنيادي خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلولهاي خوني مانند گلبول‌هاي قرمز، لنفوسيت‌هاي B وT و … تمايز مي‌يابند [9،10[.
سلولهاي بنيادي از لحاظ منشا? به دو دستهي، سلولهاي بنيادي جنيني (ESCs)10 و سلولهاي بنيادي بالغ تقسيم ميشوند. از آنجا که استفاده از سلولهاي بنيادي جنيني با مسائل اخلاقي و قانوني بسيار مواجه است و يا پيوند اين سلولها خطر ايجاد بافت توموري را در پي خواهد داشت ]7،11[، بنابراين کليد حل اين مشکل به دست آوردن منبع عظيمي از سلولهاست به گونهايکه قابليت تمايز بالايي داشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودي در محيط کشت تکثير شوند تا تعداد کافي سلول قابل دسترس براي پيوند و يا هر کاربرد درماني و پژوهشي فراهم آورد]4[.
سلولهاي بنيادي مزانشيمي از مهمترين سلولهاي بنيادي بالغ است. اين سلولها اولين بار توسط مطالعات Friedenstein و Petrokova در سال 1966 استخراج شدند ]12[. سلولهاي بنيادي مزانشيمي توان تمايز به چندين دودمان سلولي ازجمله استخوان، عصب، غضروف و كبد را دارند] 13 .[اين سلولها به عنوان يك منبع ايدهآل براي سلول درماني، ژن درماني و به عنوان ابزاري براي درمان بيماريهاي مادرزادي محسوب ميگردند] 14[. گزارشهايي مبني بر استفاده از اين سلولها در مدلهاي حيواني براي درمان جراحات نخاعي] 15،16[، سكتة مغزي ]17 [و پاركينسون] 18 [وجود دارد.
1-1 سلولهاي بنيادي جنيني:
اولين تحقيقات در زمينه ESCs در دهه 1960 شروع شد، هنگاميکه Finch و Ephrussii درسال1960 ، سلولهاي سرطاني جنيني چند توان را از سلولهاي زاياي سرطاني تمايز نيافته انسان و موش جدا کردند] 19.[
اين سلولها اولين بار در سال1981 از توده سلولي داخلي جنين موش جدا سازي شدند، سپس در سال 1998، سلولهاي بنيادي جنيني انسان استخراج شدند] 20،10.[ سلولهاي بنيادي جنيني فعاليت تلومرازي شديدي دارند و قادرند به طور نامحدودي تقسيم شوند، به گونه‌اي كه سلولهاي بنيادي جنيني انساني را مي‌توان در شرايط محيط كشت تا بيش از يكسال به صورت تمايز نيافته حفظ كرد و جمعيت آنرا به 80 برابر رساند] 10.[ حضور آلکالين فسفاتاز و تلومراز و بيان نشانگر اختصاصي SSEA-1 از ويژگيهاي اختصاصي سلولهاي بنيادي جنيني ميباشد] 21.[
اين سلولها از توده سلولي داخلي بلاستوسيست جداسازي ميشوند که داراي توانايي تمايز و تکثير نامحدود هستند و قادرند به هر سه لايه سلولي تمايز يابند، اين ويژگي را Pluripotent مينامند. محققين اولين بار اين سلولها را از mice و اخيرا” از انسان و پريماتها جداسازي کردهاند] 22، 23[. يک نکته مورد توجه در ارتباط با سلولهاي بنيادي جنيني موش اين است که اين سلولها پس از آنکه در محيط کشت و شرايط آزمايشگاهي قرار ميگيرند، تکثير شده و بعد از پيوند به جنين در مرحله قبل از کاشته شدن، ويژگي پلوريپوتنتي خود را حفظ کرده و قادرند انواع بافتهاي تمايز نيافته با منشا اکتودرمال، مزودرمال و اندودرمال را توليد کنند ]7، 24[ مشابه همين ويژگيها در سلولهاي بنيادي جنيني انسان نيز ديده شده است ]7[. بنابراين گرچه سلولهاي بنيادي جنيني از قدرت تكثير و تمايز بالايي برخوردارند اما كاربرد اين سلولها با موانع اخلاقي و قانوني همراه بوده و پاسخ ايمني را در فرد گيرنده افزايش مي‌دهند [7،11،10]. علاوه بر آن وقتي سلولهاي بنيادي جنيني انسان يا موش به حيوانات متولد شده پيوند زده ميشودند توليد تومور ميکنند که حاوي انواع متفاوتي از بافتها شامل: پوست، مو و عضله ميباشد که تراتوما ناميده ميشود ]25[، حضور سلولهايي از سه لايه جنيني در اين تومور، نشان دهنده ظرفيت تمايزي بالاي اين سلولهاست بنابراين استفاده درماني از اين سلولها با مشکلاتي همراه است]7[.
1-1 سلولهاي بنيادي بالغ
سلولهاي بنيادي بالغ، سلولهاي سوماتيکي هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلولهاي بنيادي بالغ، سلولهاي سوماتيکي هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلولهاي بافتي که از آن منشا ميگيرند، تمايز يابند. اين سلولها را مي‌توان در بافتهايي مثل استخوان تيغه‌اي (ترابكولار)، بافت چربي، مغز، سينوويوم، عضله اسكلتي، ريه، طحال، كبد، كليه، مغز استخوان، غضروف، قلب، پوست، دندانهاي شيري و سلولهاي اطراف عروق مربوط به ژله‌ وارتون بند ناف انسان نيز مشاهده نمود [14،26]. يکي از نکات مهم در مورد سلولهاي بنيادي بالغ اين است که تعداد آنها در هر بافتي محدود است. اين سلولها در حالت عادي در ناحيه خاصي از هر بافت به صورت خاموش به حالت تقسيم نشده وجود دارند و قادرند تحت شرايط فيزيولوژيك يا بدنبال ايجاد ضايعه، به سلولهاي بافتي كه در آن قرار دارند تمايز يابند و بافت آسيب ديده را ترميم كنند و يا تحت شرايط خاصي نيز به به سلولهاي ديگري كه مربوط به آن بافت خاص نمي‌باشد تمايز مي‌‌يابند، به اين ويژگي Trans-differentiation و يا Adult stem cell plasticity مي‌گويند [3،27،28].
Ferrari و همکارانش در سال 1998 اولين بار differentiatio Trans- سلولهاي BMSCs را به سلولهاي عضلاني و در همان سال Shi و همکارانش توليد سلولهاي اندوتليال از BMSCs را گزارش دادند]29،30[.Petersen توليد سلولهاي کبدي از مغز استخوان را بعد از آسيب کبدي و Brazelton و همکارانش در سال 2000 توليد نورون از BMSCs را گزارش دادند ]31،32 .[در سلولهاي استخراج شده از بافتهاي ديگر مانند عضله اسکلتي ]33 [و مغز ]34 [نيز اين قابليت تمايزي مشاهده شده است. امروزه فناوري سلولهاي بنيادي و قابليت تمايز آنها به انواع سلولهاي بالغ و همچنين استفاده از آنها در درمان بيماريها به طور روز افزوني در حال پيشرفت بوده که اميدواريهايي را در جهت ايجاد روشهاي مبتني بر سلول درماني به عنوان يک جايگزين مناسب براي پيوند اندام کامل ايجاد نموده است.
1-3 سلولهاي بنيادي مغز استخوان
سلولهاي بنيادي مغز استخوان که در گروه سلولهاي بنيادي بالغ قرار دارند شامل دو نوع
سلول بنيادي ميباشند: سلولهاي بنيادي خون ساز 11(HSCs)و سلولهاي بنيادي مزانشيمي MSCs12 ياBMSCs) )] 10،26 .[سلولهاي بنيادي مزانشيمي از مهمترين سلولهاي بنيادي بالغ هستند که به دليل دارا بودن خاصيت خود تکثيري و توان تمايزي بالا، منبع مناسبي براي استفاده در برخي روشهاي سلول درماني و ژن درماني ميباشند.
اين سلولها اولين بار توسط مطالعات Friedenstein و Petrokova در سال 1966شناسايي شدند. اين محققين سلولهاي پيشساز تشکيل دهنده استخوان13 را جداسازي کردند]12[. MSCsداراي ويژگيهايي هستند که آنها را ازHSCs ميتوان تشخيص داد، اين سلولها قابليت اتصال به ظروف کشت را دارند، از سلولهاي خونساز مغز استخوان جدا ميشوند، به صورت سلولهاي فيبروبلاست شکل، تکثير يافته و تشکيل مجموعههاي کوچک سلولي متشکل از حدودا” 50 سلول را ميدهند که به عنوان واحدهاي تشکيل دهنده کلوني فيبروبلاستي ( 14(CFU-Fsتعريف ميشود]35[. طي تحقيقاتيکه توسط Owen و Fridensteine در سال 1998و Digirolamo در سال 1999 انجام شد، نشان داده شد که کلونيهاي CFU-F از نظر شکل ظاهري، اندازه و توانايي تمايز بسيار ناهمگن هستند. مجموعهي سلولي چسبنده خيلي سريع رشد کرده، وقتي به تراکم مناسب رسيد، براي تکثير بيشتر دوباره کشت داده ميشود ]36،37[. اين سلولها قادرند قدرت تکثيري خود را بيش از 40 برابر، حفظ ميکنند] 4،38 [.
در مطالعات مختلف، سلولهاي بنيادي مزانشيمي را با نامهاي متفاوت به کار بردهاند که در جدول )1-1) آمده است ]14.[
جدول1-1 . اسامي گوناگون سلولهاي بنيادي مزانشيمي
تعريفنامسلولهاي چسبنده مغز استخوان شامل: سلولهاي شبه فيبروبلاستي ، سلولهاي اندوتليال و مونوسيت / ماكروفاژ‌ها ميباشد.Precursor of non
-hematopoietic tissueكلوني‌هاي سلولهاي فيبروبلاستي و ندرتاً مونوسيت / ماكروفاژColony forming unti-fibroblast (CFU-F)
سلولهايي كه قادرند به كف ظرف كشت بچسبندMesenchymal stem cells (MSCs)سلولهايي از مغز استخوان كه قدرت چسبندگي داشته و يا سلولهاي شبه فيبروبلاستي،سلولهاي اندوتليال و كلوني‌هاي متشکل از
مونوسيت / ماكروفاژ Marrow stromal cells سلولهاي غير خونساز (Non-hematopoietic) با منشاء مزانشيمي که از نظر ريخت شناسي شبيه سلولهاي فيبروبلاست ميباشند.-Bone marrow stromal (stem) cells (BMSSCs) and / or -Stromal precursors cells(SPCs)RS-1 سلولهاي دوكي شكل
RS-2 سلولهاي دوكي شكل و حد واسط
mMSCs سلولهاي دوكي شكل و پهن RS-1,RS-2,m MSCs (RS: Recycling stem cell) (m: mature) [39]سلولهاي پيش ساز مشتق از مغز استخوان كشت داده شدهMultipotent adult progenitor cells (MAPCs)علاوه بر موارد بالا، جمعيت سلولي به همراه سلولهاي بنيادي مزانشيمي از مغز استخوان جدا ميشوند اين سلولها را اصطلاحاً سلولهاي زاينده چند ظرفيتي بالغ 15(MAPC) مينامند و در محيط کشت به رده سلولهاي نورواكتودرمي و اندودرمي تمايز مي‌يابند [41،40،4]. اخيراً حضور MSCs در بافتهاي ديگري به غير از مغز استخوان اثبات شده است که شامل: پري استئوم، استخوان ترابکولار، بافت چربي، سينوويوم، عضله اسکلتي، پالپ دندان، بافت زير جلدي پوست پس سر، ليگامان دور دندان، خون مايع آمنيوتيک، تيموس، طحال موش و انسان بالغ ميباشد ]4، 26 .[
تاکنون دو نوع سلول بنيادي از بافت چربي استخراج شده است که با نامهاي مختلفي به کار برده ميشوند که شامل ] 16PLA10،42 [و سلولهاي بنيادي بالغي که از بافت چربي جداسازي ميشوند17(ADAS) ]10،43[. اين سلولها از توانايي تمايزي يکساني برخوردارند. بنابراين پيشنهاد شده است که يک سيستم مزانشيمي در همه بافتهاي بالغ حضور دارد. بطورتجربي MSCs که از بافت چربي و بند ناف استخراج ميشوند مشابه BMSCs، براي استفاده در درمان مورد توجه قرار گرفتهاند، البته در مواردي با BMSCs تفاوت دارند که ميتوان به اين صورت ذکر کرد: قدرت تکثير در سلولهاي مزانشيمي که از بافت چربي منشا ميگيرند بالا بوده ولي قدرت تکثير در سلولهاي مزانشيميکه از بند ناف منشا ميگيرند بسيار پايينتر است. در سلولهاي مزانشيمي که از بافت چربي استخراج شده مارکر سطحي CD106 و در سلولهاي مزانشيمي بند ناف مارکر سطحي CD90و CD105 بيان ميشود و قدرت تمايز و بيان ژن در سلولهاي مزانشيمي بند ناف کمتر است ]4،44، 45 .[
MSCs، 1/0-001/0 درصد از جمعيت سلولهاي هسته دار مغز استخوان را تشکيل ميدهند ]10،11 .[اين سلولها از توانايي ازدياد و تکثير بالايي در شرايط آزمايشگاهي برخوردار هستند و به ردههاي سلولي متعددي تمايز مييابند]4.[ MSCs همچنين ژنهايي با منشا? جنيني، مولکولهاي شرکت کننده در اتصالات بين سلولي، پروتئينهاي ماتريکس خارج سلولي مثل کلاژن تيپ 1و فيبرونکتين را بيان ميکنند. علاوه برآن، سايتوکينهايي مانند اينتر لوکين 8، 11، فاکتورهاي 18SCFوSDF-119 را ترشح و بيان ميکنند ]4،11،46[. در واقع سلولهاي بنيادي مزانشيمي موجود در مغز استخوان يک نيچ يا کنام تنظيمي براي سلولهاي بنيادي
خون ساز ايجاد ميکنند]14،47[. در اين محيط سيتوكين‌هاي آزاد شده و ميان کنشهاي بين
سلولي، نقش مهمي را در تكثير و تمايز پيش سازهاي خوني ايفا مي‌كنند [48].
1-3-1 مارکرهاي سطحي خاص سلولهاي بنيادي مزانشيمي
تلاشهاي چشمگيري براي شناسايي مارکر سلولي خاص براي سلولهاي MSCsانجام شده
است اما نشانگر اختصاصي اين سلولها هنوز شناخته نشده است. MSCsممکن است توسط عدم بيان مارکرهاي هماتوپويتيک مانند CD14، CD45، CD34 و عدم بيان مارکر اندوتليالي (CD31/PECAM-1) و بيان ترکيبي از مولکولهاي سطحي مانند SH2) CD105يا(endoglin CD73 (SH3-SH4)، CD106 (VCAM-1)، CD44 (گيرنده اسيد هيالورونيک)، CD90
(Thy1.1)، CD29، STRO-1،CD54 (ICAM-1)،CD94 ،CD13 ،CD47 ،CD164 ] 51[
] CD7149،50[، مارکرهاي فيبرونکتين] 51[ و آلکالين فسفاتاز ]48[ شناسايي ميشوند. بسياري از مارکرهاي مولکولي ديگر مانند: مولکولهاي چسبنده، کموکاينها، گيرندههاي سايتوکين مانند گيرنده فاکتور رشد اپيدرميEGFR20) يا ] (HER-14،52[ و مولکولهاي درگير در پاسخ ايمني (MHC class I and II, CD119/interferon-g-receptor)توسط MSCs بيان ميشوند]4،53.[
1-3-2 تنظيم سيستم ايمني توسط سلولهاي بنيادي مزانشيمي
سلولهاي بنيادي مزانشيمي داراي ويژگي تنظيم کنندگي سيستم ايمني مي باشند. يکي از خصوصيات مورد توجه MSCs گريز اين سلولها از شناسايي و مهار پاسخ ايمني است که اين امر به دليل خواص فنوتيپي و عملکردي آنها ميباشد]54[. خصوصيت مهاري MSCs، انواعي از عوامل سيستم ايمني شامل Tcellهاي CD+4،CD+8 ]4،55،56[،]Bcell 53،57[، سلولهاي کشنده طبيعي (NK cell)1 ]4،58 [و سلولهاي دندريتيک تمايز يافته مونوسيتها] 4،59[ را سرکوب ميکنند.
MSCs ممکن است واکنش ايمني را در شرايط in vitro و in vivo با يک روش مستقل از MHC21 مهارکنند] 4،53،60[. اگر چه در حال حاضر مکانيسمهاي دقيق سرکوب سيستم ايمني به واسطه MSCs کاملا مشخص نيست اما در مجموع، عوامل متعددي که در تنظيم سيستم ايمني و مهار ازدياد سلولهاي Tتوسط MSCs استفاده ميشود شامل ترشح فاکتورهاي رشد ( اثر غيرمستقيم) و ارتباط سلول با سلول (اثر مستقيم) ميباشد] 4،53،60[. تنظيم سيستم ايمني نهتنها توسطMSCs ، بلکه توسط سلولهاي تمايز يافته مثل فيبروبلاست، اديپوسيت و استئوبلاست نيز گزارش شده است ]4[. در مدل موش اين سلولها ميتوانند پاسخ ايمني اختصاصي به آنتيژن که با واسطه سلولهاي T خاطره و عادي ايجاد ميشود را مهار کنند که اين مسير به طورقطعي هم راستا با اتصال سلول با سلول است ]4،61[ بر خلاف مدل موش، در انسان اثرات مهاري سيستم ايمني توسط MSCs، در غياب ارتباط سلول به سلول و با واسطه ترشح فاکتورهاي محلول ميباشد] 4 ،53،60[. در بين فاکتورهاي محلول، فاکتور22?1-TGF و فاکتوررشد هپاتوسيتي23 ]4،62[، پروستاگلاندينE2 ، فاکتور رشد اندوتليوم وسکولار24 ]59،63[، ايندول آمين 2و3 دي اکسيژناز (IDO)] 53،56[، از عوامل شرکت کننده در فعاليت سرکوب ايمني توسط MSCs انساني ميباشند .در اين سلولها آنتي ژنهاي MHC کلاس 1 به مقدار کم بيان ميشوند ولي آنتيژنهايMHC کلاس 2 بيان نميشوند. عدم بيان مولکولهاي MHC کلاس2 اين امکان را به وجود ميآورد که MSCs از شناسايي سلولهاي T فرار کنند]54[. نحوه بيان آنتي ژنهايMHC کلاس1 توسط سلولهاي مزانشيمي بسيار مهم است زيرا بيان اين مولکول ها در سلولهاي بنيادي مزانشيمي باعث محافظت آنها در مقابل سلولهاي کشنده طبيعي خواهد شد. عملکرد اصلي سلولهاي کشنده طبيعي از بين بردن سلولهاي توموري است که مولکولهايMHC بر سطح آنها کاهش يافته است] 64[.MSCs علاوه بر عدم بيان مولکولهاي MHC کلاس 2، مولکول هاي کمک تحريکي از جمله CD80 (B7.1) CD86 (B7.2) و CD40L را نيز بيان نميکنند اين مولکولها براي القا پاسخ سلولهاي T عملکردي لازم هستند]54[.
MSCsتحت تاثير عوامل ريز محيطي قرار ميگيرند و به بعضي از سايتوکينهاي التهابي از جمله IL-1? ]65[،]IL17 66 [و از همه مهمتر ايتنرفرون گاما (IFN-?) پاسخ داده و عملکرد آنها به طور چشمگيري تحت تاثير قرار ميگيرد. IFN-? در بعضي از شرايط فعاليت سرکوب ايمني سلول بنيادي مزانشيمي را افزايش ميدهد] 53[.
سلولهايNK ، از عوامل اصلي ايمني ذاتي هستند که در حذف سلولهاي بدخيم و آلوده به ويروس نقش کليدي دارند ]67[. سلولهايT ،B و پيش سازهاي سلولهاي کشنده طبيعي از مغز استخوان منشا ميگيرند که در آنجا با سلولهاي بنيادي مزانشيمي بر هم کنش نزديکي دارند. نتايج چندين مطالعه بيانگر اين مطلب است که تکثير سلولهاي کشنده طبيعي در حضور IL2و IL15، توسطMSCs مهار ميگردد ]68.[ همچنينMSCs سبب القا ترشح سايتوکينهايي همچون IFN-?و TNF-? بوسيله سلولهايNK ميشوند. اثرMSCs بر توليد سايتوکينها توسط سلولهاي NKطي مطالعاتي بررسي شد. Sotiropoulou و همکارانش در سال2006 گزارش دادند که سلولهاي کشنده طبيعي فعال شده باIL2 ، بعد از کشت با سلولهاي بنيادي مزانشيمي، مقادير خيلي کمي از سايتوکينهاي القا کننده IL15 (IFN-? و به مقادير کمتر IL10 و (TNF-? را توليد ميکنند]68[، Spaggiari و همکاران نشان دادند که سلولهاي کشنده طبيعي فعال شده با IL2، بعد از مجاورت کوتاه مدت با سلولهاي بنيادي مزانشيمي IFN-? را توليد مينمايند] 58[. در مطالعهاي Poggi و همکارانش نشان داده شد که سلولهاي کشنده طبيعي تازه جدا شده، بعد از مجاورت با سلول بنيادي مزانشيمي، TNF-?و IFN-?را ترشح ميکنند، واکنش متقابل بين گيرنده ICAM-1 روي MSCs وگيرنده LFA-1 روي سلولهاي NK براي توليد سايتوکينها ضروري است ]58، 69[.
طي مطالعاتي به خوبي مشخص شده استکهIFN-? نقش مهميدر پيشبرد فعاليت سرکوبگري MSCs دارد] 70[. همسو با اين مشاهدات، Krampera و همکارانش نشان دادندکه با اضافه کردن آنتي بادي عليه گيرنده IFN-? در محيط کشت، از مهار پاسخ ايمني توسط MSCs بر روي سلولهايTCD4+ ، TCD8+ و حتي سلولهاي کشنده طبيعي ممانعت به عمل ميآيد] 53[.
از آنجائيکه MSCs عملکرد سلولهاي T خاطرهاي، سلولهاي B و سلولهاي کشنده طبيعي و همچنين تمايز و عملکرد سلولهاي دندريتيک مشتق شده از مونوسيتها را سرکوب ميکنند، پس ميتوان گفت که سلولهاي بنيادي مزانشيمي تقريباً تمام سلولهاي شرکت کننده در پاسخ ايمني را مهار ميکنند و به دليل گريز اين سلولها از شناسايي و پاسخ ايمني ضعيف، در روند درمان و پيوند حائز اهميت مي باشند] 71 .[
1-3-3 پتانسيل تمايزي سلولهاي بنيادي مزانشيمي
سلولهاي بنيادي مزانشيمي، سلولهاي چند توان multipotent)) هستند که توانايي تمايز به رده سلولهاي مزانشيمي مانند استئوسيت، کندروسيت و اديپوسيت [12، 13] را دارا هستند. علاوه بر اين سلولهاي مزانشيمي تحت شرايط آزمايشگاهي قادرند به رده سلولهاي غير مزانشيمي از جمله عضله اسكلتي [29]، عضله قلبي [72]، هپاتوسيت‌ها [31] حتي نورون و گليا نيز تمايز يابند، اين ويژگي سلولهاي مزانشيمي را Transdifferentiation مينامند. MSCs در محيط کشت حاوي ?-گليسرول فسفات ، اسيد آسکوربيک 2- فسفات، دگزامتازون و سرم جنين گاو به استئوبلاست تمايز پيدا ميکنند، همچنين در شرايط کشت سه بعدي، محيط فاقد سرم و وجود يکي از اعضاي خانواده TGF-?، به سلول هاي کندروژنيک تمايز مييابند. در اين شرايط سلولها به سرعت مورفولوژي فيبروبلاستي خود را از دست ميدهند و شروع به بيان ماتريکس خارج سلولي خاص سلولهاي غضروف مينمايند، که اين حالت با بيوسنتز سريع گليکوزآمينوگليکان و تغيير در مورفولوژي سلولها همراه ميباشد]12[.MSCs براي تمايز به رده سلولهاي چربي همراه با توليد واکوئلهاي غني از چربي، نيازمند حضور ايزوبوتيل متيل گزانتين ميباشد[12]. Taylorو Jones تمايز ميوژنيک سلولهاي جنيني و بالغ [73] و Wakitani و همکارانش، تمايز ميوژنيک سلولهاي استرومايي موش صحرايي در حضور 5- آزا سيتيدين را گزارش دادند [74]. علاوه براين Phinney و همکارانش گزارش دادند که MSCs موشي که در معرض آمفوتريپسين B قرار گرفته باشند فيبرهاي چند هستهاي ميوتوب مانند، ايجاد ميکنند [75].
MSCs استخراج شده از موش صحرايي و انسان با روشهاي مختلف کشت به سلولهاي شبه نوروني تمايز مييابند. بنابراين استفاده از اين سلولها اميد بزرگي در درمان بيماريهاي نورو-
دژنراتيو ميباشد ]76، 77[.
در شرايط فيزيولوژيک،MSCs قابليت تمايزي و خود تکثيري بالايي دارند. مطالعات نشان داده، که سلولهاي بنيادي عصبي25((NSCs نيز بدليل دارا بودن چنين ويژگيهايي همواره مورد توجه محققان بودهاند]78،79[، اين سلولها نه تنها قادرند به سلولهايي با منشا اکتودرمي تمايز يابند بلکه قادرند به سلولهاي خوني نيز تمايز يابند] 32[. همين ويژگي در سلولهاي بنيادي مزانشيمي نيز ديده شده است بطوريکه آنها به سلولهايي با منشا غير مزودرمي مانند سلولهاي عصبي نيز تمايز مييابند. Tershikh و همکارانش در سال 2001 نشان دادند که يکسري فاکتورهاي نسخه برداري توسط هر دو سلولهايMSCs و NSCs بيان ميشود، از جمله ژن اريتروپويتين- فاکتور رشد خونساز و رسپتورش، در مغز انسان، ميمون و موش بيان ميشوند] 80[. ارتباط بين بيان ژنهاي مختلف در اين دو گروه، بدليل ظرفيت تمايزي بالا و يکي از فاکتورهاي مسئول پلاستيسيتي اين سلولها ميباشدکه در هر دو مطالعات in vitro و in vivo مشاهده شده است ]78[.
تاکنون روشهاي متعددي مبني بر تمايز MSCs به نورون گزارش شده است که شامل:
– القاگر شيميايي
– سايتوکينها
– هم کشتي26 با سلولهاي عصبي
– القاگر شيميايي به همراه سيتوکينها
– سيتوکينها به همراه انتقال ژني] 81، 82[.
تيمار MSCs باisobutylmethylxanthine و AMP Dibutyryl cyclic که از عوامل افزايش دهنده cAMP درون سلولي ميباشند، موجب تمايز اين سلولها به سلول عصبي مي‌گردد ]83.[ Woodbury در سال 2000 سلولهاي بنيادي مزانشيمي انسان و موش صحرايي را در محيط كشت تا بيش از 20 پاساژ پيش برد و سپس سلولها را در معرض محيط كشت فاقد سرم‌ و حاوي بتامركاپتواتانول (BME) يا ديمتيل سولفوکسيد و butylated hydroxyanisol قرار داد، اين سلولها فنوتيپ سلول عصبي را نشان دادند و بدين ترتيب حدود 80% از سلولهاي کشت شده NSE27 و NF-M28 را بيان کردند ]78،84.[
مطالعات Sanchez-Ramos و همكارانش نشان داد كه MSCs انسان داراي ظرفيت تمايز به سلولهاي عصبي ميباشند. در اين تحقيقات از اسيد رتينوئيك، فاكتور رشد اپيدرمي (EGF)29 و BDNF30، جهت تمايز سلولهاي استرومايي به سلولهاي عصبي استفاده شد که به دنبال آن تعدادي از سلولها، ماركر عصبي NeuN31 (حدود 5%) و تعدادي ديگر ماركر آستروسيتي GFAP32 (حدود 1%) را دو هفته بعد از کشت بيان كردند ]78[. متعاقبا همکشتيMSCs با سلولهاي مزانسفاليک جنيني، تعداد سلولهاي تمايز يافته را به حداقل دو برابر افزايش ميدهد]51،78 [.
MSCs وقتي با سايتوکينهاي متفاوتي مثل EGFو bFGF همراه ميشوند دچار تغييرات
دراماتيک شده، به سلولهاي شبه عصبي تمايز مييابند و مارکرهاي خاص نوروني مثل نستين، نوروفيلامنتها، MAP-233، ?III-tubulin و NeuN را به ميزان بالايي بيان ميکنند]4[. علاوه بر اين، همکشتي MSCs و سلولهاي بنيادي عصبي بالغ ((NSC و تزريق اين سلولها به داخل مغز حيوان، منجر به بلوغ بيشتر اين سلولها و تمايز آنها به سمت سلولهاي نوروني و گليالي بالغ ميشود] 4،85،86[. در تحقيقات اخير گزارش شده است که، همکشتي MSCs با سلولهاي شوان، تمايز به نورون را در اين سلولها القا ميکند ]87[. حتي MSCs که در مراحل اوليه تمايز نوروني هستند(neural-primed MSC) براي تمايز نهاييشان با آستروسيت]85، 86[ يا سلولهاي شوان همکشتي شدند و مورفولوژي نوروني يا آستروگليالي بالغ را نشان دادند]4.[ همکشتي بين MSCs و NSCs جسم مخطط مغز مياني34 جنين ، باعث تمايز NSCs به سلولهاي بيان کننده آنتي ژنهاي عصبي Nestin، Tuj1 و GFAPشده است[88].
Jiang و همکارانش در سال 2002 گزارش دادند که در اثر هم کشتي MAPCs با آستروسيتهاي اوليه، نورونهايي ايجاد ميشوند که خصوصيات يک نورون کارا مانند توليد پتانسيل عمل و بيان کانالهاي سديمي را نشان ميدهند. اين سلولهاي MAPCs همچنين قادرند تيروزين هيدروکسيلاز (TH)35، دوپامين و دوپا دکربوکسيلاز را همانند نورونهاي دوپامينرژيک در in vitro بيان کنند [89].
Jin و همکارانش در سال 2008 گزارش دادندکه همکشتي MSCs با سلولهاي پيشساز عصبي جنيني E13.5)) بيان THرا در NSCsجنيني افزايش ميدهند. افزايش بيان TH به علت ترشح فاکتورهاي رشد عصبي مانند NGF36، BDNF از MSCs ميباشد[90]. مشابه به همين نتايج نيز در همکشتي سلول PC12 با MSCs مشاهده شده است [91].


دیدگاهتان را بنویسید