1-7. بيماري زايي سياه سرفه 21
1-8. علائم کلينيکي 22
1-9. تشخيص بيماري 23
1-9-1. تشخيص باليني23
1-9-2. علائم کلينيکي در نوزادان24
1-9-3. کودکان، نوجوانان و بزرگسالان25
1-10. پاسخ ايمني در برابر سياه سرفه 26
1-10-1. پاسخ ايمني همورال27
1-10-2. پاسخ ايمني سلولي28
1-11. روش هاي آزمايشگاهي تشخيص.30
1-11-1. کشت30
1-11-2. سرولوژي30
1-11-3. PCR 32
1-12. مديريت بيماري33
1-13. پيشگيري 34
1-13-1. راهبردهاي بالقوه در مهار بيماري سياه سرفه در اوايل نوزادي35
1-13-1-1. واکسيناسيون بالغين و سالمندان37
1-13-1-2. حفاظت غيرمستقيم نوزادان از طريق واکسيناسيون والدين37
1-13-1-3. ايمن سازي نوزادان و کودکان38
1-13-1-4. واکسيناسيون مادر در دوران بارداري38
1-14. استراتژي هاي واکسن39
1-14-1. واکسن غير سلولي سياه سرفه39
1-14-2. واکسن سلولي سياه سرفه40
فصل دوم: مروري بر متون گذشته
2-1. تاريخچه توليد واکسن سياه سرفه42
2-1-1. تعريف تست كنترل سميت زدايي (MWGT) 43
2-1-2. تعريف تست حفاظتي داخل مغزي موش (تست توانمندي Potency test) 44
2-1-3. ابداع روش کشت44
2-1-4. جداسازي سلول باکتري از کشت45
2-2. تاريخچه توليد واکسن سياه سرفه در انستيتو رازي46
2-3. غيرفعال سازي سوسپانسيون سلولي باکتري سياه سرفه47
2-3-1. استفاده از فرمالين و تيومرسال براي سميت زدايي سوسپانسيون سلولي سياه سرفه47
2-3-2. استفاده از گلوتار آلدهيد براي سميت زدايي سوسپانسيون سلولي سياه سرفه49
2-3-3. استفاده از حرارت براي سميت زدايي سوسپانسيون سلولي سياه سرفه49
فصل سوم: مواد و روش ها
3-1. تجهيزات و وسايل 51
3-2. مواد و محيط ها 52
3-2-1. محيط کشت آگار بورده ژانگو52
3-2-2. محيط کشت وِروِي53
3-2-3. محيط B254
3-2-4. محيط کشت سويابين کازئين54
3-2-5. محيط تيوگليکولات براث55
3-3. روش کار 56
3-3-1. انتخاب سويه هاي بوردتلا پرتوسيس56
3-3-1-1. ليوفيليزه کردن56
3-3-2. کشت باکتري سياه سرفه56
3-3-2-1. کشت تجديد حيات روي محيط بورده ژانگو56
3-3-2-2. کشت بذر روي محيط وِروِي57
3-3-2-3. مراحل انجام کشت فرمانتوري باکتري سياه سرفه57
3-3-2-3-1. استريليزاسيون فرمانتور57
3-3-2-3-2. آماده سازي و بهينه سازي محيط کشت فرمانتوري58
3-3-2-3-3. تلقيح بذر به محيط کشت در فرمانتور58
3-3-3. جداسازي باکتري سياه سرفه از محيط کشت59
3-3-3-1. جداسازي سلول باکتري با استفاده از سانتريفوژ59
3-3-3-2. جداسازي سلول باکتري با استفاده از سيستم ميکرو فيلتراسيون59
3-3-4. غيرفعال سازي سلول باکتري سياه سرفه60
3-3-5. سميت زدايي سوسپانسيون باکتري سياه سرفه60
3-3-5-1. سميت زدايي با استفاده از فرمالين61
3-3-5-2. سميت زدايي با استفاده از تيومرسال61
3-3-6. تست هاي کنترلي سوسپانسيون سياه سرفه61
3-3-6-1. تست استريليتي61
3-3-6-2. تست کنترل غيرفعال بودن باكتري62
3-3-6-3. تست کنترل سميت زدايي (MWGT) 62
3-3-6-4. تست توانمندي62
فصل چهارم: نتايج
4-1. تجديد حيات بذر بر روي محيط بورده ژانگو64
4-2. تهيه بذر در محيط وِروِي64
4-3. کشت فرمانتوري باکتري سياه سرفه براي توليد واکسن64
4-4. جداسازي باکتري سياه سرفه از کشت67
4-5. غيرفعال سازي و سميت زدايي باکتري سياه سرفه براي توليد واکسن69
4-5-1. سميت زدايي با فرمالين69
4-5-2. سميت زدايي با تيومرسال69
4-6. آزمايش هاي کنترلي سوسپانسيون هاي سياه سرفه69
4-7. نتايج حاصل از آزمون MWG در کنترل توکسيسيتي سوسپانسيون هاي سلولي سياه سرفه
سميت زدايي شده با فرمالين و تيومرسال72
4-8. آزمون MWG و مقايسه تغييرات اوزان موش ها75
4-9. تست توانمندي واکسن هاي آزمايشي سياه سرفه80
فصل پنجم: بحث و پيشنهادات
بحث 83
نتيجه گيري و پيشنهادات 88
منابع89
خلاصه انگليسي 97
ضمايم 98
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول1-1. آنتي ژن هاي مختلف سياه سرفه9
جدول1-2. علائم کلينيکي بيماري سياه سرفه26
جدول1-3. آنتي بيوتيک هاي مورد استفاده در درمان سياه سرفه حاد و رژيم مصرف آن34
جدول1-4. واکسيناسيون سياه سرفه در کشورهاي مختلف36
جدول2-1. ترکيب محيط ليستر و B2 بر اساس گرم در ليتر45
جدول3-1. ليست دستگاه ها و تجهيزات مورد استفاده51
جدول3-2. ليست مواد و محيط هاي مورد استفاده در توليد واکسن سياه سرفه52

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

جدول3-3. ترکيبات محيط بورده ژانگو53
جدول3-4. ترکيبات محيط کشت وِروِي53
جدول3-5. ترکيبات محيط کشت B254
جدول3-6. ترکيبات محيط کشت سويابين کازئين55
جدول4-1. اطلاعات دوره كشت باكتري سياه سرفه براي توليد واكسن68
جدول4-2. نتايج حاصل از انجام آزمايش هاي غيرفعال سازي و استريليتي سوسپانسيون هاي باكتري سياه سرفه سميت زدايي شده با فرمالين70
جدول4-3. نتايج حاصل از انجام آزمايش هاي غيرفعال سازي و استريليتي سوسپانسيون هاي باكتري سياه سرفه سميت زدايي شده با تيومرسال71
جدول4-4. نتايج حاصل از کنترل توکسيسيتي سوسپانسيون هاي سميت زدايي شده با فرمالين و تيومرسال با استفاده از آزمون MWG73
جدول4-5. نتايج كنترل توکسيسيتي سوسپانسيون هاي سميت زدايي شده با فرمالين با استفاده از آزمون MWG76
جدول4-6. نتايج كنترل توکسيسيتي سوسپانسيون هاي سميت زدايي شده با تيومرسال با استفاده از آزمون MWG77
جدول4-7. نتايج حاصل از انجام تست توانمندي براي شش واکسن تجربي سميت زدايي شده با فرمالين (FDV)80
جدول4-8. نتايج حاصل از انجام تست توانمندي براي شش واکسن تجربي سميت زدايي شده با تيومرسال (TDV)81
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار1-1. مقايسه تعداد افراد زير يک سال ايمن شده با واکسن DTP در سه کشور مختلف در سال
2000 تا 2010 6
نمودار4-1. تغييرات pH کشت سويه 134 از باکتري سياه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور65
نمودار4-2. تغييرات pH کشت سويه 509 از باکتري سياه سرفه در طول دوره رشد درفرمانتور65
نمودار4-3. مقايسهي ميانگين جذب نوري در طول موج هاي530 و590 در مقدار جرم باكتري در هنگام برداشت در بچ هاي مختلف سويه 134 و 50966
نمودار4-4. مقدار غلظت نهايي باكتري سياه سرفه (cell109×1) سويه 134 در پايان دوره كشت در هنگام برداشت66
نمودار4-5. مقدار غلظت نهايي باكتري سياه سرفه (cell109×1) سويه 509 در پايان دوره كشت در هنگام برداشت67
نمودار4-6. مقايسه دوره ي سميت زدايي سوسپانسيون هاي سلولي سياه سرفه سويه 134 توسط فرمالين و تيومرسال با استفاده از تست MWG 74
نمودار4-7. مقايسه دوره ي سميت زدايي سوسپانسيون هاي سلولي سياه سرفه در سويه 509 توسط فرمالين و تيومرسال با استفاده از تست MWG74
نمودار4-8. مقايسه اختلاف وزن موش هاي تزريق شده با واكسن تجربي سميت زدايي شده با فرمالين نسبت به تيومرسال در سويه 13478
نمودار4-9. مقايسه اختلاف وزن موش هاي تزريق شده با واكسن تجربي سميت زدايي شده با فرمالين
نسبت به تيومرسال در سويه 50978
نمودار4-10. مقايسه اختلاف وزن موش هاي تزريق شده با سوسپانسيون هاي سميت زدايي شده سويه 134 با تيومرسال و فرمالين نسبت به موش هاي گروه كنترل79
نمودار4-11. مقايسه اختلاف وزن موش هاي تزريق شده توسط واكسن سياه سرفه حاصل از سميت
زدايي با فرمالين وتيومرسال در سميت زدايي درسوش509 توسط تست MWG 79
نمودار4-12. مقايسه نتايج حاصل از توانمندي واكسن هاي تجربي سميت زدايي شده با فرمالين (FDV) با واكسن هاي تجربي سميت زدايي شده با تيومرسال((TDV 81
فهرست اشكال

عنوان صفحه
شكل1-1. كوكوباسيل سياه سرفه7
شكل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسيس به سلول هاي پوشش مژه دار مجاري تنفسي9
شكل1-3. شماي شماتيك از پرتوسيس توكسين11
شكل3-1. فرمانتور استفاده شده براي كشت سياه سرفه58
خلاصه فارسي
سياه سرفه بيماري عفوني باكتريال دستگاه تنفس است كه عامل آن بوردتلا پرتوسيس از دسته باكتري هاي گرم منفي مي باشد. در اين مطالعه شش بچ از سويه هاي 134 و 509 باكتري سياه سرفه تهيه شده و مورد مقايسه قرار گرفتند. از دو روش فيزيكي سانتريفوژ و ميكروفيلتراسيون براي جداسازي سلول باكتري از محيط كشت استفاده گرديد. سپس سلولهاي جداسازي شده باكتري درPBS خنك و استريل در غلظت متوسط Ou/ml 150-100 حل شده و به دو قسمت تحت نامهاي سوسپانسيون سميتزدايي با فرمالين (FD) و سوسپانسيون سميت زدايي با تيومرسال (TD) تقسيم شدند. به سوسپانسيون هايFD بعد از غيرفعال سازي در حرارت 56 درجه سانتيگراد بمدت 10 دقيقهmM 10فرمالين (7/37 %) اضافه گرديد و به سوسپانسيون هايTD در شرايط مشابه، بعد از غيرفعال سازي با حرارت، w/v 01/0 % تيومرسال بصورت محلول اضافه شد. سپس هر دو سوسپانسيون در دماي 8-4 درجه سانتيگراد براي سميت زدايي انكوبه شدند. در روزهاي 10، 30، 90، 180 و 270 از هر دو نوع سوسپانسيون نمونه برداري شد تا سميت آنها با انجام تست افزايش وزن موش (MWG) مورد ارزيابي قرار گيرد. در نهايت نيز شش واكسن آزمايشي FD وTD از مخلوط كردن غلظت هاي مشابه دو سويه 134 و 509 تهيه گرديد تا بتوان توانمندي اين واكسن ها را در تست حفاظتي موش با تستKendrick ارزيابي نمود. نتايج حاكي از آن بود كه روش سميت زدايي با فرمالين با ميانگين دوره 6/26 روز در مقايسه با روش سميت زدايي با تيومرسال با ميانگين دوره 195 روز، روش كوتاهتري از نظر زماني براي سميت زدايي سوسپانسيون سلولي سياه سرفه است. توانمندي واكسن تجربي حاصل از سميت زدايي با فرمالين با ميانگين 9/5 از واكسن تجربي حاصل از سميت زدايي با تيومرسال با ميانگين 95/5 قدري كاهش را نشان داده است. براساس نتايج حاصل، فرمالين با كاهش دوره سميت زدايي در درجه حرارت 8-4 درجه سانتيگراد بميزان 5/7 برابر بسيار مناسب تر از تيومرسال بود. اگرچه توانمندي واكسن حاصل از روش سميت زدايي با تيومرسال حدود 05/0 واحد بيشتر از واكسن حاصل از سميت زدايي با فرمالين است ولي تفاوت از نظر آماري ناچيز بود.
کليدواژهها: بوردتلاپرتوسيس- سميت زدايي- تيومرسال- فرمالين- تست افزايش وزن موش (MWG) – تست حفاظتي موش با تست kendrik
فصل اول
کليات
1-1. بيان مسأله
بيماري سياه سرفه يك عفونت تنفسي بوده كه توسط باكتري بوردتلا پرتوسيس1 از دسته باكتريهاي گرم منفي ايجاد مي شود. نشانه عمده بيماري سرفه هايي است كه ممكن است تا چند هفته نيز طول بكشد كه مشخصه آن پاروكسيزمال2 شديد با سرفه هاي ناگهاني است كه اغلب خاتمه آن با يك دم همراه مي باشد. بيماري در نوزادان و اطفال بيشتر رخ مي دهد (2و18).
در توليد واکسن سلولي سياه سرفه به روش سنتي و جاري آن در مؤسسه واكسن و سرم سازي رازي جدا سازي باكتري به روش ترسيب با اسيدكلريدريك انجام گرفته و سپس به منظور سميت زدايي3 توکسين هاي موجود در سوسپانسيون سلولي باکتري سياه سرفه از تيومرسال و انکوباسيون درسردخانه به مدت طولاني 12-9 ماه استفاده مي گردد. جدا سازي جرم باكتري با استفاده از اسيد از يك سو و فرآيند طولاني سميت زدايي با مرتيولات از سوي ديگر منجر به کاهش توانمندي واکسن مي گردد. لذا در اين پروژه با جايگزيني روش هاي جدا سازي فيزيكي باكتري از محيط كشت بجاي روش شيميايي از يك سو آسيبهاي احتمالي به ساختار سلولي باكتري را كاهش داده و از سوي ديگر با استفاده از فرمالين بجاي تيومرسال زمان مورد نياز براي سميت زدايي سوسپانسيون سلولي سياه سرفه به حداقل تقليل يافت تا ضمن کاهش دوره فرآوري آنتي ژن بتوان فرآورده اي با کيفيت مناسب تر را توليد نمود (4).
1-2. تاريخچهي بيماري سياه سرفه
اولين شيوع بيماري سياه سرفه توسط Guillame De Baillou شناخته شد كه اپيدمي آن در تابستان 1578 در پاريس اتفاق افتاد (11). بيشترين اثراين اپيدمي بر روي نوزادان و اطفال بود كه باعث ايجاد مرگ و مير بالايي شد. ظاهراً بيماري قبلاً در فرانسه شناخته شده است، زيرا De Baillou به پنجمين اسم مشترك اين بيماري اشاره كرده است. او فرض مي كرد بيماري بايد به صورت صداي سرفه يا 5 ساعت تشنج متناوب منعكس شود. يك بيماري از 16 قرن پيش مانندchyne-cough شناخته شده كه شايد پرتوسيس بوده باشد و در سال 1701 در لندن مدت ها سياه سرفه وchyne-cough به صورت مرگ و مير ظهور مي كرده است (12). سيدنهام اصطلاح پرتوسيس را به هر بيماري كه با سرفههاي شديد همراه بود اطلاق كرد ولي اين نام در اواسط قرن هجدهم به بيماري همه گيري محدود شد كه ماهيت باليني مشخص داشت (2).
بوردت (Bordet) و ژانگو (Gengou) اولين افرادي بودند كه باكتري سياه سرفه را در سال 1906 در آزمايشگاه كشت دادند و چندي بعد واكسن خام بر عليه اين باكتري ساخته شد (22).
اولين واکسن سياه سرفه توسطMedcen در سال 1933 تهيه شد. در اين روش سلول هاي باکتري سياه سرفه از محيط كشت جدا و سپس با استفاده از گرما غير فعال شدند (60).
قبل از استفاده گسترده از واكسن سلولي سياه سرفه4، در آمريكا 270000 مورد بيماري سياه سرفه هر سال با بيش از 10000 مرگ و مير گزارش شده است (11).
وقوع بيماري سياه سرفه بعد از واكسيناسيون جمعي كودكان در دهه ي 1940 با واكسن سلولي به طور چشمگيري كاهش پيدا كرد و بيشترين كاهش آن در سال 1976 با تعداد 1010 نفر بيمار گزارش شده است (54).
اما از آن به بعد شيوع بيماري دوباره سير صعودي پيدا كرد كه بيشترين افزايش از سال 1959 به بعد بود كه بيش از 2500 نفر در سال 2004 به بيماري مبتلا بودند. افزايش اين بيماري در آمريكا در بين اطفال و بزرگسالان احتمالاً ناشي از كمشدن ايمني القا شده توسط واكسن و همچنين افزايش امتناع از واكسيناسيون در اين گروه سني بوده است. از آنجا كه غالباً بيماري سياه سرفه تشخيص داده نميشود بنابراين تعداد واقعي بيماري از تعداد گزارش شده خيلي بيشتر مي باشد. گزارشات سال 2008 هم نشان ميدهد كه شيوع اين بيماري در نوزاداني كه سن آنها به سني نرسيده كه سه دوز از واكسن محتوي سياه سرفه را دريافت نمايند در حال افزايش مي باشد (18).
در طول سال هاي 2000 الي 2004 بطور متوسط سالانه 2488 مورد از اين بيماري در آمريكا گزارش شده كه شامل كودكان كمتر از يك سال است كه 63% آنها در بيمارستان بستري شده اند (22).
سياه سرفه در سراسر جهان يك مشكل مهم در كودكان بشمار مي آيد. سازمان جهاني بهداشت5 (WHO) اعلام كرده است كه سالانه در جهان 45 ميليون مورد از اين بيماري ديده مي شود كه از اين تعداد 301408 نفر از كودكان در سال 2002 تلف شده اند (18).
علي رغم اينكه بيش از 6 دهه از تاريخ واكسيناسيون مدرن مي گذرد، سياه سرفه هنوز هم يكي از رايج ترين بيماري هايي است كه توسط واكسن قابل پيشگيري است. گزارش شده است كه بيماري سياه سرفه در برخي از جمعيت هاي واكسينه شده در سال هاي 1980 و 1990 دوباره عود داشته است (8).
يكي از عوامل مهمي كه واكسيناسيون نتواند ايمني كامل ايجاد كند آداپته شدن پاتوژن با سيستم ايمني و كاهش القاي سيستم ايمني توسط واكسن مي باشد (48).
با وجود پوشش بالاي واکسيناسيون، بيش از پانزده سال است كه بازگشت عفونت سياه سرفه در سراسر جهان مشاهده مي شود. در حالي که بيماري کلاسيک سياه سرفه در دوران قبل از واكسيناسيون در درجه اول، يک بيماري دوران کودکي بوده، امروزه با واکسيناسيون گسترده، بروز بيماري بيشتر به نوجوانان و بزرگسالان انتقال يافته است.
آمار ارائه شده توسط مراکز کنترل بيماري و پيشگيري6 (CDC) از سال 2004 نشان مي دهد موارد بيماري در افراد سنين 19-10 سال بميزان 19برابر و در افراد بالاتر از 20 سال به 16 برابر افزايش يافته است (22).
در واقع نوجوانان و بزرگسالان نقش قابل توجهي در انتقال سياه سرفه به نوزادان و کودکاني دارند که نسبت به بروز عوارض بيماري و مرگ و مير ناشي از آن آسيب پذيرتر مي باشند.
نمودار 1-1 مقايسه تعداد افراد زير 1سال ايمن شده با واكسنDTP در سه كشور مختلف در سال 2000 تا 2010
از عوامل متعدد در افزايش بروز بيماري سياه سرفه ميتوان از نقصان عملكرد ايمني پس از عفونت طبيعي و يا حتي خود واکسيناسيون نام برد. لذا بمنظور جلوگيري ار انتقال بيماري از نوجوانان و بزرگسالان به نوزادان و كودكان گسترش استراتژي واکسيناسيون از جمله ايمن سازي جهاني نوجوانان و بزرگسالان بخصوص، کارکنان بهداشت، پرستاران کودکان و والدين نوزادان، ميتواند به کنترل بيماري سياه سرفه كمك شاياني نمايد. سياه سرفه يک تهديد جدي براي نوزادان و كودكان و تا حد زيادي نوجوانان و بزرگسالان است از اينرو، افزايش آگاهي پزشکان با بيماري سياه سرفه و روش هاي استاندارد تشخيص آن و عمل به استراتژيهاي مختلف واکسيناسيون براي افزايش کنترل اين بيماري حائز اهميت بود (22).
درسراسر جهان، سالانه50 ميليون مورد سياه سرفه اتفاق مي افتد که %90 در کشورهاي در حال توسعه مي باشد. نوزادان، گروه آسيب پذير با بالاترين ميزان عوارض و مرگ و ميرهستند، با اين حال کودکان، نوجوانان و بزرگسالان در حال حاضر درصد قابل توجهي از موارد را تشکيل مي دهند و يک منبع انتقال عفونت به نوزادان هستند.
PCR، كشت و سرولوژي روشهاي اصلي تشخيص آزمايشگاهي سياه سرفه بوده كه عوامل مختلفي بر حساسيت و ويژگي هر يك از روش هاي مذكور مؤثر مي باشد. با اين حال، در سالهاي اخير، PCR به يك روش مناسب با تأثير قابل توجه در افزايش تشخيص آزمايشگاهي سياه سرفه تبديل شده است (22).
1-3. باكتريولوژي
عامل ايجاد كننده سياه سرفه، يك باسيل كوچك گرم منفي و پلي مورف است (شكل1-1). اگرچه ارگانيسم صد سال پيش در ترشحات و نمونه هاي پاتولوژيك كودكان مبتلا به بيماري سياه سرفه شناسايي شده بود ولي اين ارگانيسم تا سال 1906 كه بوردت (Bordet) و ژانگو (Gengou) با استفاده از محيط كشت مخصوص موفق به كشت آن در آزمايشگاه شدند، تكثير نشده بود. هنوز در بسياري از آزمايشگاه ها از محيط بوردت-ژانگو براي تكثير اين باكتري استفاده مي نمايند.
تاكنون محيط هاي سنتتيك مختلفي براي رشد و تكثير اين باكتري براي توليد واكسن طراحي و بكار گرفته شده است (18).
شكل1-1.كوكوباسيل سياه سرفه
دو ارگانيسم ديگر نيز در جنس بوردتلا به نام بوردتلا پاراپرتوسيس 7و بوردتلا برونشي سپتيكا8 وجود دارد که پاراپرتوسيس مسئول سندرمي شبيه پرتوسيس در انسان است كه معمولاً شدتش از پرتوسيس كمتر است. برونشي سپتيكا بيماريهاي تنفسي در حيوانات خانگي را ايجاد مي كند. چون ساختارهاي DNA اين دو ارگانيسم به طور ضروري همانند بوردتلا پرتوسيس است، ممكن است آنها در حقيقت سه ارگانيسم زير گونه از يك باكتري يكسان باشند (54و10).
بين همه ي گونه هاي بوردتلا، فقط بوردتلا پرتوسيسPT را سنتز مي كند. اگرچه كروموزوم بوردتلا پاراپرتوسيس و بوردتلا برونشيسپتيكا داراي لوكوس ژنPT است اما رونويسي آنها بدليل پروموتور ناقص خاموش مي باشد. در فاز حاد، هر سه ارگانيسم فاكتورهاي ويرولانس مشابه ايجاد مي كنند.
بعضي از تحقيقات عدم وجود اطلاعات در مورد اين بيماري را تا قبل از قرن 16 ميلادي ناشي از سازگاري ارگانيسمهاي حيواني با انسان در 5 قرن گذشته ميدانند. اگرچه شواهد اخير نشان ميدهد كه ارتباط بوردتلا پرتوسيس با انسان ها ممكن است قديميتر از آنچيزي باشد كه قبلاً تصور مي شد (54).
اخيراً سويه هايي از پرتوسيس شناسايي شده اند از جمله بوردتلا هولمسي9 كه در بيماران واجد نقص ايمني10 منجر به باكتريمي11، اندوكارديت12 و بيماري هاي تنفسي مي گردد. سويه ديگر مي توان از بوردتلا هينزي13 نام برد كه از خون بيمار مبتلا به ايدز و همچنين از ترشحات دستگاه تنفسي بيمار مبتلا به سيستيك فيبروزيس14جدا شده است. اگرچه بسياري از فعاليت هاي بيولوژيكي بوردتلا پرتوسيس از مدت ها پيش مشخص شده بود اما تلاش ها براي يافتن تركيبات مسئول هر يك از فعاليت هاي متنوع اين ارگانيسم براي سال ها ناموفق باقي ماند. بهر حال وقتي تركيبات و اجزاي اختصاصي ارگانيسم مشخص شد نه تنها باعث افزايش درك پاتوژنيسيته بيماري شد بلكه در نهايت منجر به خالص سازي اين اجزاء و توليد واكسن غيرسلولي سياه سرفه15 شد (18).
بوردتلا پرتوسيس تمايل ويژه اي براي اتصال شديد به سلول هاي پوششي مژه دار16 در مجاري تنفسي دارد. باكتري ممكن است وارد سلول هاي پوششي شود اما بطور معمول نمي تواند وارد سلول هاي غشاء پايه17 شده و يا به داخل گردش خون تهاجم نمايد (شكل1-2). به هر حال توكسين هاي توليد شده توسط باكتري مي تواند به جريان خون وارد شده و عوارض سيستميك را ايجاد نمايد. آنتي ژن هاي بوردتلا پرتوسيس كه در واكسن هاي غير سلولي بكار مي رود و همچنين ساير آنتي ژن هاي اين باكتري در جدول 1-1 ذكر شده است (18).
شكل1-2. اتصال بوردتلا پرتوسيس به سلول هاي پوششي مژه دار مجاري تنفسي
جدول 1-1 . آنتي ژن هاي مختلف باكتري سياه سرفه
اجزا تشكيل دهندهفعاليتهاي بيولوژيكيتوكسين پرتوسيس(PT) Pertussis Toxinاگزوتوكسين ترشحي كه لنفوسيتوز ، حساسيت به هيستامين ، فعال سازي سلول هاي جزيره اي پانكراس و تقويت ايمني را تحريك مي كندفيلامنتوس هماگلوتينين
Fillamataus Hemaglutininدر اتصال باكتري به سلول مژه اي اپيتليوم در مجاري تنفسي دخالت داردفيمبريه Fimbriaeدر اتصال باكتري به سلول مژه اي اپيتليوم در مجاري تنفسي دخالت داردپرتكتين Pertactinپروتئين غشاي خارجي كه موجب تسهيل اتصال باكتري به سلول مژه اي اپيتليوم تنفسي مي شودBrkAپروتئين غشاي خارجي كه نقش واسطه براي اتصال به سلول هاي اپيتليوم را داشته و در مقابل كمپلمان مقاومت مي كندآدنيلات سيكلاز Adenylate Cyclaseمانع عملكرد فاگوسيتوز مي شوداندوتوكسين Endotoxineموجب تب مي شود و واكنش موضعي در حيوان و احتمالاً انسان را منجر مي شودتراكئال سايتوتوكسين Tracheal Cytotoxinمنجر به استاز و اثرات سايتو پاتيك در موكوس تراكئال مي شوددرمونكروتيك يا توكسين ناپايدار به گرما Dermonecrotic Or Heat Labile Toxinباعث نكروز پوستي و انقباض عروق در حيوانات مي شود
1-4.تركيبات مهم باكتري سياه سرفه
بوردتلا پرتوسيس داراي دو دسته عوامل ويرولانسي مي باشد :
دسته اول را ادهسين هايي تشكيل ميدهند كه شامل فيلامنتوس هموگلوتينين، پرتكتين، فيمبريه و BrkA هستند كه در اتصال باكتري به سلولهاي مژكدار دستگاه تنفسي فوقاني و ماكروفاژها دخيل هستند.
دسته دوم عوامل ويرولانسي باكتري، توكسين هايي هستند كه در آسيب موضعي و سيستميك به ميزبان شركت داشته و شامل پرتوسيس توكسين، آدنيلات سيكلاز توكسين، تراكئال سايتوتوكسين، درمونكروتيك توكسين و اندوتوكسين مي باشد (1).
1-4-1. توكسين پرتوسيس
قبلاً به توكسين پرتوسيس يا PT 18 فاكتور تحريك كننده لنفوسيتوز‌19 (LPF) مي گفتند، كه مهمترين عامل پاتوژنز سياه سرفه بود و به طور عمومي باور بر اين است نقش مهمي در القاء و ايجاد ايمني باليني دارد. PT يك ساختار اوليگومري مركب از 5 ساب يونيت20 مختلفS1 تا S5 است. به طور ساختاري PT به كلاس A-B از توكسين باكتريايي تعلق دارد. جزءS1 پروموتوري است كه ريبوزيلاسيون ADP از پروتئين هاي اتصالي تنظيميGTP21 را كه در انتقال سيگنال در سلول يوكاريوت نقش دارد كاتاليز مي كند. پروموتورA يا همان جزءS1 تا حد زيادي مسئول سازماندهي فعاليت هاي بيولوژيكيPT شامل ارتقاء لنفوسيتوزيس22، تحريك سلول هاي جزيره اي پانكراس23، حساسيت به هيستامين، كلاسترينگ24 سلول هاي CHO 25و خاصيت ادجواني آن مي باشد. اوليگومرB ساختار حلقه اي شكل است كه محتوي يك كپي از هر يك از ساب يونيت هاي S2 ، S3 ، S5 و دو كپي ازS4 است. وظيفه مهم اوليگومر B تسهيل اتصال PT به سلول‌هاي مژه‌دار مخاط مجاري تنفسي است. علاوه بر آن اوليگومر B فعاليت‌هاي آنزيمي نظير هموگلوتيناسيون26و ميتوژنيسيتي27 سلول‌هاي لنفوسيت T را نيز دارا مي‌باشد.
شكل1-3. شماي شماتيك از پرتوسيس توكسين
کل مولکول PT براي اکثر فعاليت‌هاي آنزيمي پروموتور A لازم مي‌باشد، از اينرو پروموتور A در غياب اليگومر B هيچ‌گونه عملکردي نخواهد داشت. سويه‌هاي مختلف بوردتلاپرتوسيس که از نظر توليد آگلوتينين مختلف مي‌باشند همگي يک نوع PT را توليد مي‌کنند که PT توليدي واجد خواص سرولوژيكي و بيولوژيکي يکساني مي‌باشد (56و47).
PT توسط بوردتلا پاراپرتوسيس يا برونشي سپتيکا توليد نمي‌شود، اگرچه اين ارگانيسم‌ها محتوي ژن‌هايي هستند که مي‌تواند فرم فعال PT را در اين ميکروارگانيسم ها کد کند، اما پروموتورهاي اين ژن‌ها غير فعال بوده و لذا توکسين توليد نمي‌شود (30).
PT چندين نقش اصلي را در بيماري‌زايي پرتوسيس دارد، اگرچه مکانيسم‌هاي دقيق عملکرد آن چندان واضح نمي‌باشد. PT اتصال بوردتلا پرتوسيس به سلول‌هاي مژه‌دار مجاري تنفسي را تسهيل مي‌نمايد و در توکسيسيتي28 سلول دخالت دارد. همچنين PT در کلونيزاسيون سلول باکتري در مجاري تنفسي از طريق جلوگيري از مهاجرت نوتروفيل و نقش‌آفريني آنها در طول اولين هفته بعد از عفونت و جلوگيري از پاکسازي اوليه باکتري توسط آنتي‌بادي نقش دارد.
به نظر مي‌رسد که PT استراتژي خاصي را براي بروز عفونت حاد و تداوم دوره عفونت حتي در حضور آنتي بادي براي هجوم باکتري فراهم مي‌نمايد. و جالب‌تر اينکه تزريق داخل وريدي PT در افراد داوطلب بالغ هيچ‌گونه عوارضي را ايجاد نمي‌کند (48).
PT يک ايمونوژن قوي است و آنتي‌بادي‌ها برعليه PT نقش مهمي را در ايمني باليني برعليه سياه‌سرفه ايفا مي‌کنند. در آزمايشگاه تزريق آنتي‌بادي‌هاي PT به موش‌ها منجر به ايجاد ايمني در آنها برعليه تست چلنج داخل مغزي باکتري زنده (تست کندريک29) و يا تست چلنج استنشاقي30‌مي شود (56و57).
چلنج موش‌هايي که به طور فعال با تزريق ساب‌يونيت‌هاي PT ايمن شده و يا به طور غيرفعال با آنتي‌بادي‌هاي مونوکلونال عليه ساب‌يونيت‌هاي PT گوناگون ايمن شده اند، نشان مي‌دهدکه کل مولکول PT براي ايجاد ايمني مناسب لازم و ضروري است. توکسوئيد PT توليد شده به روش شيميايي يا ژنتيکي به عنوان جزئي از واکسن غيرسلولي سياه‌سرفه به‌کار مي‌رود (48).
1-4-2. فيلامنتوس هموگلوتينين (FHA)
FHA 31 يک مولکول سنجاقي شکل بزرگ است که ابتداء به صورت يك Precursor با وزن مولکولي 367 کيلو دالتوني ساخته شده و سپس با شکست مولکولي در دو طرف به فرم بالغي از پروتئين با وزن 220 کيلو دالتون تبديل مي‌شود.
مطالعات آزمايشگاهي بيان مي‌کند که FHA يک ادهسين32 با 4 دومن اتصالي مجزا است که اتصال به مونوسيت‌ها، ماکروفاژها، سلول‌هاي اپيتليوم مژه‌دار و حتي سلول‌هاي غيرمژه‌دار اپيتليوم تنفسي را تسهيل مي‌کند (63).
داده ها نشان ميدهد کهFHA نقش ايمونومدولاتوري نيز دارد. اثر متقابل FHA با رسپتورهاي ماکروفاژها ترشح اينترلوکين12را از طريق مکانيسم اينترلوکين10 سرکوب مي‌نمايد که اين امر منجر به عدم پاسخگويي Th1 و درنهايت پايداري باکتري در بدن مي‌گردد (39). ژن ساختماني هماگلوتينين كلون شده است و از طريق مهندسي ژنتيك قادر هستند كه آن راجهت استفاده در واكسن هاي جديد توليد كنند (2).
باکتري‌هاي موتاسيون يافته فاقد FHA قدرت ناچيزي در باند شدن به سلول‌هاي پوششي تنفسي دارند. ايمن کردن موش‌ها با FHA آنها را در مقابل چلنج تنفسي با باکتري زنده سياه‌سرفه محافظت مي‌نمايد اما در مقابل چلنج داخل مغزي با باکتري زنده سياه‌سرفه بي‌تأثير است.
با اينحال FHA يک ايمونوژن قوي است و آنتي‌بادي‌هاي سرمي عليه FHA بعد از عفونت طبيعي و واکسيناسيون با واکسن‌هاي حاوي اين پروتئين ظاهر مي‌شود. نتايج يکي از مطالعات اپيدميولوژي در فنلاند حاکي از اين است که آنتي‌بادي‌هاي FHA در دانش‌آموزان با حفاظتشان در برابر بيماري سياه سرفه مرتبط است (65).
1-4-3. فيمبريه و آگلوتينين‌ها
فيمبريه33 پروتئيني پلي‌مريک و فيلامنتوس34 است که توسط باکتري سياه‌سرفه به صورت خارج سلولي بيان مي‌شود. بيش از دوازده آگلوتينوژن35در غشاء خارجي سلول باکتري سه گونه ي مختلف از جنس بوردتلا وجود دارد که دو نوع شناخته شده از اين آگلوتينوژن‌ها، فيمبريه ناميده مي‌شود. بر اين اساس دو واژه آگلوتينوژن و فيمبريه مشابه يکديگر نبوده و نبايد بجاي يكديگر به کار روند.
الگوي آگلوتينوژن در ميان سه گونه بوردتلا با هم فرق مي‌کند. حدود هشت آگلوتينوژن در بوردتلاپرتوسيس يافت شده است که از اين تعداد 6 آگلوتينوژن در اين گونه اختصاصي بوده و از اين شش آگلوتينوژن، سه آگلوتينوژن 1، 2 و 3 در بيماري‌زايي و ايمني عليه بيماري اهميت دارند (18).
آنتي‌بادي‌ها عليه اين آگلوتينوژن ها در مطالعات سرواپيدميولوژي بکار مي‌روند. مطالعات In vivo نشان مي‌دهد که سويه‌هاي بوردتلاپرتوسيس توانايي تکثير در مجاري تنفسي36 و تراکئاي موش37 را ندارند. سويه‌هاي بوردتلا برونشي سپتيکا عاري از فيمبريه نيز با اينکه قادر به بيان FHA و ديگر ادهسين‌ها هستند در کلونيزاسيون لوله تنفسي حيوان ناتوان مي باشند (14).
آنتي‌بادي‌هاي سرمي عليه فيمبريه معمولاً بعد از بيماري طبيعي يا ايمني فعال با واکسن محتوي اين پروتئين‌ها ايجاد مي‌شود. شواهد زيادي دال بر نقش آنتي‌بادي آگلوتينوژن‌ها در ايجاد ايمني باليني وجود دارد.
مؤيد اين نقش کاهش توانمندي آن دسته‌ از واکسن سلولي سياه‌سرفه که آگلوتينوژن‌هاي موجود در واکسن با آگلوتينوژن‌هاي سويه‌هاي سياه‌سرفه شايع همسان نمي‌باشد، خواهد بود.
شواهد آزمايشگاهي وجود دارد که وجود نوعي تغيير38 آنتي ژنيك را در سروتايپ هاي باکتري سياه‌سرفه پس از کشت‌هاي متوالي نشان مي‌دهد. همچنين شواهدي وجود دارد که نشانگر بروز تغييرات سروتيپي اين باکتري در طول بروز بيماري در بيماران مي باشد.
داده‌هاي سرواپيدميولوژي39 از کشور انگلستان نشان داد که بين سال‌هاي 1941 و 1953 سويه‌هاي رايج بوردتلاپرتوسيس محتوي آگلوتينوژن هاي 1، 2، 3 بوده‌اند. در حاليکه اين مطالعات در سال 1968 نشان داد که 75% از سويه‌هاي بوردتلاپرتوسيس جدا شده در اين کشور تنها واجد دو نوع آگلوتينوژن 1و2 بوده‌اند. دليل اين امر شايد کمبود آگلوتينوژن 3 در واکسن‌هاي مصرف شده در اين برهه از زمان مي باشد. واکسني که واجد آگلوتينوژن 3 بيشتري بوده است توانمندي بيشتري نسبت به ساير واکسن‌ها در پيشگيري از بيماري در اين مقطع زماني داشته است (9).
البته امکان دارد که تفاوت در سروتيپ‌هاي سياه‌سرفه که براساس آگلوتينوژن‌ها مي‌باشد در درون خود تفاوت هايي را نيز در ساير مارکرهاي آنتي‌ژنيک داشته باشد. اما قدر مسلم اين است که اين تفاوت در ساير آنتي‌ژن‌ها، نظير PT را شامل نخواهد شد، چراکه PT در تمام سويه‌هاي سياه‌سرفه يکسان مي‌باشد.
نتايج حاصل از بيماري در انسان، مدل موشي و تحقيقات آزمايشگاهي نشان داد که آنتي‌بادي عليه فيمبريه (FIM) نقش مهمي را در ايجاد ايمني عليه بيماري ايفاء كرده است.
از آنجا که آگلوتينوژن‌ها نقش مهمي را در القاء ايمني برعليه بيماري سياه‌سرفه دارا مي‌باشند سازمان جهاني بهداشت (WHO)توصيه کرده است که واکسن سياه‌سرفه سلولي محتوي آگلوتينوژن 1، 2 و 3 باشد و اخيراً دارا بودن دو نوع آگلوتينين 1و 2 را ضروري دانسته اند (21).
1-4-4. پرتکتين
پرتکتين40يا PRN که در ابتداء پروتئين 69 کيلو دالتوني41 ناميده مي‌شد، پروتئين سطحي است که پس از تحمل يک برش پروتئوليتيکي به غشاء خارجي سلول فرستاده مي‌شود. پروتئين‌هاي مشابهي نيز توسط بوردتلا پاراپرتوسيس و برونشي سپتيکا توليد مي‌شوند.
PRN بواسطه موتيف (RGD) Arg- Gly- Asp، اتصال باکتري به سلول يوکاريوت و سپس تهاجم به آن را تسهيل مي‌نمايد. PRN بسيار ايمونوژنيک است. آنتي‌بادي عليه PRN بعد از بيماري طبيعي يا ايمني فعال با واکسن‌هاي محتوي اين پروتئين توليد مي‌شود (63).
موش‌هايي که بطور غيرفعال با آنتي‌بادي‌هاي PRN ايمن شده‌اند مقاومت بالايي در چلنج با آئروسل کشنده سويه ويرولانت بوردتلا پرتوسيس دارند. اگرچه در چلنج داخل مغزي موش‌هاي ايمن شده با PRN تنها زماني که با FHA نيز ايمن شده باشند، مقاومت مي‌نمايند (50).
مطالعاتي که در هلند انجام شده است نشانگر وجود تغييرات ژنتيکي در مولکول‌هاي PRN (و حتي PT) بوده که منجر به تغيير آنتي ژنيك سويه‌هاي رايج به سمت واريانت‌هايي شده است كه در واكسن استفاده شده در جامعه حضور ندارند (18).
مطالعات بعدي در مدل موشي نشان داد که واکسن سياه‌سرفه سلولي هلندي اثر کمتري را در مقابل ويرولانت‌هاي PRN نسبت به ساير ويرولانت‌ها دارا مي‌باشد. در مقابل انستيتو سانوفي پاستور فرانسه طي يک مطالعه اعلام نمود که ژنوم باكتري استفاده شده در واکسن ليوفيليزه چندگانه سياه‌سرفه اين مرکز با گذشت سال‌ها از ذخيره‌سازي آن در سال 1984 تا 2002 تغييري نيافته و کليه توکسين‌ها و ادهسين‌ها را نيز توليد مي‌نمايد (49).


دیدگاهتان را بنویسید