3-2-1- استخراج نماتدهاي کرمي شکل از خاک18
3-3- استخراج ماده هاي متورم جنس Meloidogyne از ريشه19
3-4- کشتن، ثابت کردن و انتقال نماتدها به گليسيرين خالص20
3-5- تهيه اسلايد هاي ميکروسکوپي21
3-5-1- تهيه اسلايدهاي دايم از نماتدهاي کرمي شکل21
3-5-2- تهيه برش از شبکه کوتيکولي انتهاي بدن ماده هاي بالغ جنس Meloidogyne و تهيه اسلايد ميکروسکوپي22
3-6- مشخصات مورفولوژيک و مورفومتريک مورد استفاده در تشخيص گونه ها22
3-6-1- مورفومتري و رسم تصاوير24
3-7- جداسازي نماتد هاي ريشه گرهي و خالص سازي آنها26

3-8- استخراج DNA ژنومي چند جمعيت از جنس Filenchus :27
3-8-1-انجام واکنش PCR :27
3-8-2-روش دستي PCR28
3-8-3- تشخيص فرآورده هاي PCR29
فصل چهارم31
نتايج و بحث31
4-1- نتايج31
4-2- شرح جنس ها و گونه هاي شناسايي شده32
4-2-1- جنس Aphelenchus Bastian,186532
4-2-1-1- گونه Aphelenchus avenae Bastian , 186532
4-2-1-2- گونه Aphelenchus isomerus Anderson & Hooper,198033
4-2-2- جنس Basiria siddiqi,195934
4-2-2-1- گونه Basiria graminophila siddiqi,195935
4-2-3- جنس Boleodorus Thorne, 194137
4-2-3-1- گونهBoleodorus thylactus Thorne, 194137
4-2-4- جنس Ditylenchus Filipjev,193639
4-2-4-1- گونه Ditylenchus medicaginis Wasilewska, 196539
4-2-4-2- گونه Ditylenchus tenuidens Gritzenko, 197140
4-2-5- جنس Filenchus Andrassy,1954 (Mey,1961)42
4-2-5-1- گونه Filenchus cylindricaudus (wu,1969) siddiqi, 198643
4-2-5-2- گونه Filenchus thornei (Thorne & Malek,1968)Siddiqi,198644
4-2-5-3- گونه Filenchus vulgaris (Brzeski,1963) Lownsbery ,198546
4-2-6- جنس Geocenamus Thorne & Malek,196847
4-2-6-1- گونه Geocenamus tenuidens , Thorne & Malek, 196848
4-2-7- جنس Helicotylenchus Steiner, 194551
4-2-7-1- گونه Helicotylenchus egyptiensis, Tarjan, 196452
4-2-7-2- گونه Helicotylenchus pseudorobustus (Steiner,1964) Golden ,195653
4-2-8- جنس Irantylenchus Kheiri, 197255
4-2-8-1- گونه Irantylenchus clavidorus, Kheiri,197256
4-2-9- جنس Meloidogyne Goeldi, 189257
4-2-9-1-گونه Meloidogyne javanica (Treub,1885) chitwood, 194959
4-2-10- جنس Merlinius siddiqi, 197061
4-2-10-1- گونه Merlinius brevidens (Allen,1955) siddiqi,197061
4-2-11- جنس Neopsilenchus Thorne & Malek, 196863
4-2-11-1- گونه Neopsilenchus magnidens (Thorne,1949) Thorne & Malek, 196864
4-2-12- جنس Pratylenchus Filipjev, 193666
4-2-12-1- گونه Pratylenchus Coffeae (Zimmermann, 1898)Filipjev & Schuurmans Stekhoven, 194166
4-2-12-2-گونه Pratylenchus neglectus (Rensch, 1924) Filipjev & Schuurmans stekhoven, 194167
4-2-12-3- گونه Pratylenchus thornei, Sher & Allen ,195368
4-2-13- جنس Psilenchus, deman, 192170
4-2-13-1- گونه Psilenchus iranicus, Kheiri,197071
4-2-14- جنس Tylenchorhynchus, Cobb, 191372
4-2-14-1- گونه Tylenchorhynchus goffarti, Sturhan, 196674
4-2-14-2- گونه Tylenchorhynchus solani, Gupta & Uma, 198274
4-2-15- جنس Zygotylenchus Siddiqi, 196376
4-2-15-1- گونه Zygotylenchus guevarai (Tobar jimenz, 1963) Braun & Loof,196676
فصل پنجم79
نتيجه گيري کلي و پيشنهادات79
5-1- نتيجه گيري کلي79
5-2- پيشنهادات79
منابع81
فهرست جداول
جدول3-1: مکان، زمان و نوع آبياري در نمونه هاي خاک جمع آوري شده16
جدول 3-2: مشخصات ريشه هاي آلوده به نماتد Meloidogyneجمع آوري شده19
جدول 3-3-: اجزاء واکنش PCR براي ژن ITS28
جدول 3-4-: برنامه PCR مورد استفاده براي ژن ITS29
جدول 4-1: خصوصيات مورفومتريک دوگونه از جنس Aphelenchus (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).34
جدول 4-2: خصوصيات مورفومتريک يک گونه از جنس Basiria (اندازه ها برحسب ميکرومتر).36
جدول4-3: خصوصيات مورفومتريکي يک گونه از جنس Boleudorus (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).38
جدول 4-4: خصوصيات مورفومتريک دو گونه از جنس Ditylenchus از استان خراسان رضوي(اندازه ها بر حسب ميکرومتر).42
جدول4-5: خصوصيات مورفومتريک سه گونه از جنس Filenchus (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).47
جدول4-6: خصوصيات مورفومتريکي يک گونه از جنس Geocenamus از استان خراسان رضوي (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).50
جدول4-7: خصوصيات مورفومتريک دو گونه از جنس Helicotylenchus (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).55
جدول4-8: خصوصيات مورفومتريک يک گونه از جنس Irantylenchus (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).57
جدول4-9: خصوصيات مورفومتريکي شبکه کوتيکولي انتهاي بدن ماده هاي بالغ و لاروهاي سن2، گونه Meloidogyne javanica از استان خراسان رضوي (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).60
جدول4-10: خصوصيات مورفومتريک يک گونه از جنس Merlinius (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).63
جدول4-11: خصوصيات مورفومتريک گونه Neopsilenchus magnidens (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).65
جدول4-12: خصوصيات مورفومتريک سه گونه از جنس Pratylenchus (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).70
جدول4-13: خصوصيات مورفومتريک يک گونه از جنس Psilenchus (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).72
جدول4-14: خصوصيات مورفومتريک دو گونه از جنس Tylenchorhynchus (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).75
جدول4-15: خصوصيات مورفومتريک يک گونه از جنس Zygotylenchus (اندازه ها بر حسب ميکرومتر).77

فهرست اشکال
شکل 3-1- نقشه مکان هاي نمونه برداري توسط دستگاه GPS17
شکل 3-2- نتيجه الکتروفورز محصول PCR ونمايشگر محدوده ي مارکر30
فصل اول
مقدمه و اهميت تحقيق
1-1-گياهشناسي خانواده کدوئيان
1-1-1-گياه شناسي خربزه ، منشأ و تاريخچه
نام علمي خربزه Cucumis melo L.
عقيده کلي بر اين است که منبع اوليه خربزه آسيا است و چون شاهدي دال بر کاشت آن در زمان هاي قديم موجود نيست ، احتمالاً در زمان هاي قديم کاشت نمي شده است .
به نظر متخصصان طبقه بندي گياهي ناحيه اصلي و منبع اوليه خربزه به شکل کنوني کشور ايران و قفقاز و کشورهاي همسايه ايران است. نظريه ديگر دانشمندان طبقه بندي گياهي بر اين است که گونه هاي مختلف در آسيا و آفريقا به طور مجزا پديدار گشتند )مبرلي 1987) .
مطالعه تحقيقات موجود نشان مي دهد مراکز ثانوي خربزه در هندوستان ، ايران ، جنوب روسيه و چين بوده است . خربزه بهترين نتيجه را در آب و هواي گرم و خشک مي دهند .اين گياه بر اساس منشأ خود طالب گرما و به ويژه نور است . هواي ابري و باراني در موقع رسيدن ميوه باعث مي شود که خربزه طعم مطبوع و کيفيت لازم را پيدا نکند . دوره رويش اين گياهان طولاني تر از دوره رويش خيار بوده و بين 80 تا 100 روز متفاوت است . هرچند که خربزه در طيف وسيعي از انواع خاک ها کشت مي شود ولي تنها در خاک هاي حاصلخيز که داراي مواد غذايي آلي و معدني کافي باشند بهترين نتيجه را مي دهند . ارقام کشت شده در ايران عبارتند از : تاشکندي ، مشهدي عباسي ، گرگاب ، شاه آبادي ، جعفري ، خاقاني ، حـاج ماشاءاللهي ، گرمساري ، محمد آبادي ، مجيدي ، روستاق ، صابوني ، جعفر آبادي ، عباس شوري ، سوسکي ، تخم محمد ، بلخي ، زرد ايوانکي ، شفيع آبادي ، شيرازي ، جارجو ، زابلي ، آتشين و شهسواري
1-1-2-گياه شناسي خيار ، منشأ و تاريخچه
نام علمي Cucumis sativus
گياهي دولپه متعلق به خانواده کدوييان، علفي ويکساله، گلها زرد رنگ ودرمناطق نيمه گرمسيري مي رويد خيار بومي آسياوآفريقا بوده و هزاران سال پيش کشت ميگرديده است و منشأ پيدايش آن دامنه هاي سلسله جبال هيماليا در هندوستان بوده است. درايران از هزاران سال پيش از ميلاد وجود داشته است(مبرلي 1987).
1-1-3-گياه شناسي طالبي، منشأ و تاريخچه
نام علمي Cucumis meloگياهي دولپه متعلق به خانواده کدوييان، علفي ويکساله، گلها زرد رنگ تا نارنجي وبومي آسياي جنوب غربي است. طالبي قدمت 4 هزار ساله دارد و بيشترين سطح زير کشت و توليد را ايران و هند بر عهده دارند.
. براي نخستين بار اسم طالبي در اروپا در سال 1388 ميلادي به وسيله وايکليف برده شده که از آن به عنوان ميوه خوراکي ياد شده است. واريته هاي مختلف طالبي در نقاط مختلف جهان به دو صورت ميوه و سبزي مصرف ميشوند (مبرلي 1987).
1-1-4-گياه شناسي کدو، منشأ و تاريخچه
نام علمي کدو(نژادهاي مختلف):
Cucurbita pepo ، Cucurbita mixta ، Cucurbita maxima
Pampkin که گياهي يک پايه است که در آمريکاي شمالي به آن کدوي زمستاني گفته مي شود وبومي آمريکاست.بين 0.5 تا 34 کيلو وزن دارد و قديمي ترين شواهد نشان مي دهد که تخم هاي اين کدو 7 هزار سال قبل از ميلاد مسيح در مکزيک کنوني يافت شده است.ميوه آن رنگي زرد تا نارنجي و گاهي سبز تيره و حتي خاکستري و قرمز ديده مي شود. بزرگترين کشورهاي توليد کننده هاي آن آمريکا،مکزيک، هند وچين است. بهترين رطوبت خاک مورد نياز براي اين گياه cm 7.62 مي باشد.
Squash که بومي مکزيک و آمريکاي مرکزي است و به کدوي تابستاني معروف است،ميوه ي آن به رنگ زرد بوده وحاوي مقادير زيادي ويتامين c و پتاسيم است. اولين گزارش ها از برداشت کدوي تابستاني در آمريکاي مرکزي به حدود 8000 تا 10000 سال قبل باز مي گردد.
Zucchini نوع ديگري از کدوي تابستاني است که در ايران بع عنوان کدو خورشتي مصرف مي شود و در دو نوع سبز تيره و روشن موجود است،بوته ي آن داراي گل هاي زرد 5 پر مي باشد و اولين بار در آمريکا ديده شده است ولي کشت آن درايتاليا توسعه يافته است (مبرلي 1987).
1-1-5-گياه شناسي هندوانه، منشأ و تاريخچه
نام علمي Citrullus lanatus
گياهي خزنده، داراي گل هاي نر و ماده ي مجزا و منفرد مي باشد.هندوانه متعلق به مناطق گرمسيري است كه به يك دوره ي رشد طولاني نياز دارد(مقاوم به سرما نيست).
منشا هندوانه آفريقا در مصر مي باشد. بنابر نظريه فشر پرورش اين گياه ابتدا در مصر قديم و سپس هندوستان آغاز شد.يعني هندوستان مركز ثانويه ي انتشار هندوانه مي باشد.
گلدهي و رشد ميوه نسبت مستقيم با نور ودما دارد.برگ ها قلبي شکل يا پنجه اي مي باشند و رشدش از طريق ساقه ي رونده انجام مي شود.هندوانه ريشه هاي گسترده و كم عمق با يك ريشه ي مستقيم و ريشه هاي جانبي فراوان دارد.
گل هاي هندوانه شامل: گل هاي نر، ماده و گل هاي كامل(هرمافروديت) مي باشدو معمولا گلدهي با رشد ساقه هاي رونده توام است،يعني رشدي نا محدود دارند (مبرلي 1987).
1-2- نيازهاي محيطي خانواده کدوئيان
گياهان خانواده کدوئيان معمولا گرما دوست و کليه ارقام آن حساس به سرما مي باشند. درجه حرارت پايه براي جوانه زني گياه 12درجه سانتي گراد مي باشد و در 25 تا 27 درجه بهترين رشد را داراست. در مورد کشت گياه بايد به طول فصل رشد توجه خاص نمود چون توجه به شرايط آب و هوايي منطقه و بررسي آمار چند ساله هواشناسي براي تنظيم تاريخ کشت بسيار مهم است. مناسب ترين Ph براي کاشت کدوئيان بين 6 تا 7 مي باشد . در خاک هاي اسيدي رشد آن کاهش يافته و برگ ها به رنگ زرد مايل به سبز در مي آيند .
بخصوص در مناطق کويري ونيمه کويري استان خراسان رضوي که سرماي ديررس بهاره يا سرماي زود رس پاييزه طول فصل رشد را کوتاه مي کنند خساراتي از قبيل سرمازدگي رابه وجود مي آورندو گاهي دماي نامناسب رشدي سبب اختلال در اتمام مراحل رشد و نمو گياهيان اين خانواده مي شود. کدوئيان در طيف وسيعي از انواع خاکها، از خاک رسي نسبتًا سنگين تا خاک شني سبک کشت ميشود.
1-3- بررسي وضعيت سطح زير کشت، عملکرد و توليد در جهان
طبق آخرين آمارنامه منتشره در سال 86 ، سطح زير کشت خربزه در ايران 79992 هکتار و بيشترين سطح زير کشت متعلق به استان خراسان رضوي با 45553 هکتار مي باشد که حدود 57% از سطح کل کشور را شامل مي شود . سطح کل زير کشت جهاني طبق آمار فائو در سال 2009 ، 1308018 هکتار بوده و ايران حدود 1/6% از سطح زير کشت جهان را به خود اختصاص داده است .
متوسط عملکرد خربزه در ايران 4/15 تن در هکتار و بيشترين عملکرد را استان تهران با حدود 32 تن در هکتار داشته است . ميانگين عملکرد جهاني 6/21 تن و بيشترين عملکرد متعلق به کانادا با 120 تن در هکتار بوده و کشور چين به عنوان مهمترين کشور توليد کننده 1/26 تن در هکتار عملکرد دارد. در ايران استان خراسان رضوي به عنوان مهترين توليد کننده خربزه در ايران داراي عملکرد متوسط 14 تن در هکتار مي باشد.
کل توليد خربزه در کشور 1221631 تن و استان هاي مهم توليد کننده ، خراسان رضوي با 636459 تن ، سمنان با 119078 تن و خوزستان با 138709 تن مي باشند . استان خراسان رضوي 57% از توليد کشور را در اختيار دارد.
1-4- بيماري هاي مهم کدوئيان
بيماري ها يکي از عوامل محدود کننده کشت کدوئيان به شمار مي روند از جمله مي توان قارچها، باکتريها، ويروسها و نماتدها را ذکر نمود که مهمترين آنها عبارتند از:
سپتوريوز کدوئيان- آنتراگنوز کدوئيان که در خيار،کدوخورشتي،طالبي وهندوانه ديده مي شود، موزائيک خيار که توسط شته Aphis gassypii منتقل مي شود و سفيدک دروغي خيار درخيار و طالبي و گموز کدوئيان مي باشند.
1-5- اهميت و اهداف تحقيق
عوامل زيادي در انتخاب محصولات خانواده کدوئيان و توسعه کشت آن در کشورو استان خراسان رضوي وجود دارد،ازجمله اين عوامل مي توان به دارا بودن رتبه اول ايران و استان خراسان رضوي در صادرات خربزه و طالبي به کشورهاي عربي حوزه خليج فارس و ديگر کشورها اشاره کرد که سهم زيادي در اقتصاد کشاورزي ايران بر عهده دارند.
به منظور اهميت استان مورد نظر از نظر توليد محصولات خانواده کدوئيان و خسارت زا بودن نماتد هاي انگل گياهي بر روي اين محصولات و نيز با توجه به اينکه در رابطه با نماتدهاي انگل گياهي آنها هيچ گونه بررسي وتحقيق کاملي در استان وحتي با جامعيت خانواده اي در کشور صورت نگرفته است، لذا به عنوان اولين و مهمترين قدم، شناسايي نماتدهاي انگل گياهي اين محصولات در استان ضروري به نظر مي رسد. نماتدهاي انگل گياهي مي توانند از تمام قسمت هاي گياه تغذيه کنند.
برخي از اين گونه ها فقط از خارجي ترين بافت هاي گياهي تغذيه مي نمايند، تعدادي ديگر به بافت هاي عميق تر نفوذ مي کنند. خسارت ناشي از تعداد کمي نماتد معمولا ناچيز است ولي جمعيت هاي زياد آنها صدمه شديدي را وارد نموده ويا موجب از بين رفتن ميزبان مي گردند. بعلاوه ، برخي از نماتد ها نيز ويروس هاي بيماريزا را در بين گياهان انتقال مي دهند ( دراپ کين، 1989).
فصل دوم
بررسي منابع
2-1- اهميت نماتد هاي انگل گياهي بر روي خانواده کدوئيان
نماتدهاي انگل گياهي در کليه ي نقاط کشاورزي جهان يافت شده و هر محصولي مورد حمله و خسارت آن ها قرار مي گيرد. نماتدهاي انگل گياهي نقش مهمي در کاهش توليد سبزي ها ايفا مي کنند که بستگي به بزرگي و وسعت سيستم کشاورزي به کار رفته دارد به طوريکه در سيستم هاي چند کشتي و وسيع و سيستم هاي بين کشتي در کشاورزي اهميت کمتري دارند ولي در سيستم کشت هاي متمرکز اهميت خيلي زيادي پيدا مي کنند. در سيستم کشت تک محصولي يا در مزرعه اي که به طور متوالي و پشت سرهم ميزبان حساس کشت مي شود، جمعيت آنها افزايش يافته و مي توانند خسارتزا باشند. در سيستم هاي چند کشتي خسارت شديد حاصل از نماتدها معمولا به مرور زمان رخ مي دهد ولي در محصولاتي که به صورت تک کشتي کشت مي گردند، خسارت سريعتر اتفاق مي افتد( سيکورا و فرناندز، 2005).
2-2- مطالعات انجام شده در جهان و ايران
دربررسي نماتدهاي گلخانه هاي خيار و گوجه فرنگي شهرستان اسکس در اونتاريو جانسون و بوخوون در سال 1969 شش جنس Aphelenchoides ، Aphelenchus ، Helicotylenchus ، Meloidogyne ، Pratylenchus و Tylenchus را گزارش کردند.. مولينف نيز در سال 1973 در مطالعه اي که بر روي پراکنش نماتدهاي انگل گياهي در جنوب ازبکستان انجام داد دريافت که از ميان گونه هاي جنس Meloidogyne تنهاگونه ي M. javanica به عنوان انگل محصولات طالبي مشاهده مي شوند.
در بررسي نماتدهاي بيماريزا بر روي محصولات زراعي در کشور السالوادور واهميت مديريت آنها پينوچت و همکاران در سال 1987 دريافتند،گونه هاي جنس Meloidogyne بيشترين تهاجم را به گياهان طالبي، هندوانه ،بادمجان ،لوبيا و پنبه بر عهده داشته است.
نودا وهمکاران در سال 1999 از آناليز 150 نمونه ريشه و خاک و 50 نمونه خاک جمع آوري شده از مزارع کدوئيان ونزوئلا دريافتند که گونه ي Pratylenchus brachyurus بيشترين اهميت را در خسارت زايي گياه طالبي،خيار،هندوانه و کدو دارد،درحاليکه M. incognita بيشترين جمعيت را به ترتيب در ريشه ي گياهان طالبي،خيار،هندوانه وکدو خورشتي دارا بوده است.
همچنين گونه هاي ديگري از قبيل Helicotylenchus dihystera، Belonolaimus lineatus ، Tylenhorynchus annulatus در خاک اطراف ريشه کدوئيان مشاهده شدند.
آنتون و همکاران در مطالعه اي که در سال 2000 بر روي خسارت ناشي از نماتد M. incognita برگياه طالبي صورت پذيرفت از مدل رياضي Seinhorst در برآورد خسارت اقتصادي مزارع جنوب کاليفرنيا استفاده کرد.
در سال 2007 هووارد و همکاران نيز نماتدهاي ريشه گرهي و مولد زخم را از مهمترين گونه هاي خسارت زاي خانواده کدوئيان معرفي کردند که داراي يبيشترين تراکم جمعيتي در ريشه و خاک اطراف ريشه اين گياهان بودند.
آيسنورتن و همکاران نيز در سال 2002 در مطالعه اي که بر روي نماتد هاي انگل گياهي خانواده Tylenchida در ترکيه بر روي گياه هندوانه انجام داد،توانست 25 گونه نماتد را شناسايي کند که گونه ي Pratylenchus fallax براي اولين بار در فون نماتدهاي ترکيه گزارش شد،از ديگر گونه هاي شناسايي شده در اين بررسي مي توان به Filenchus cylindricauda ،Ditylenchus destructor ، Merlinius nanus و Boleodorus thyllactus اشاره کرد.
عبدالگاد و همکاران در سال 2007 درمصرجنس هايCriconemoides, Ditylenchus, Helicotylenchus Heterodera, Hirschmanniella, Meloidogyne, Pratylenchus, Rotylenchulus,
Tylenchus رابر روي گياهان خيار،کدوحلوايي وهندوانه گزارش کردند، درحاليکه جنسهايHoplolaimus
و Trichodorusتنها بر روي هندوانه مشاهده شدند و 4 جنسPratylenchus, Hirschmanniella, Tylenchorhynchus و Meloidogyne ازبالاترين سطح جمعيتي در کل محصولات کدوئيان برخوردار بودند.
در تحقيقي که در دانشگاه نبراسکا توسط هووارد وهمکاران در سال 2007 انجام پذيرفت ،آنها نماتدهاي ريشه گرهي و مولد زخم را ازمهمترين گونه هاي خسارت زاي خانواده کدوئيان معرفي کردند که داراي بشترين تراکم جمعيتي در ريشه و خاک اطراف ريشه اين گياهان مي باشند.
در تحقيقات راهبردي مديريت نماتدهاي انگل گياهي خانواده کدوئيان که در سال 2009 در دانشگاه ديويس کاليفرنيا توسط وستردال و همکارانش صورت گرفت،دريافتند که بيشترين خسارت مربوط به نماتدهاي ريشه گرهي و نماتدهاي مولد زخم مي باشند ، همچنين به حساسيت بيشتر تمامي ارقام کدوئيان به M. incognita و M. javanica پي بردند،درحاليکه کدوئيان به ميزان کمتري به M. hapla حساسيت نشان دادند.
نماتدهاي مولد زخم نيز که شامل گونه هاي جنس Pratylenchus مي باشند،با تغذيه از بافت هاي ريشه و تضعيف آنها از مقاومت در برابر ساير عوامل بيماري زا جلوگيري مي کنند.وستردال و همکارانش در رابطه با روش هاي زراعي کنترلي،تناوب بدون گياه ميزبان را مهمترين روش جلوگيري از خسارت اين گونه ها بر محصولات خانواده کدوئيان بر شمرده اند.
به منظور شناسايي نماتدهاي انگل گياهي خسارت زا بر روي سبزيجات و محصولات جاليزي، بامي و همکاران در سال 2009 در کشور بنين در غرب آفريقا تعداد 171 ريشه گياه و 171 نمونه خاک از 26 منطقه جمع آوري کردندکه در نهايت 11 گونه نماتد شناسايي شدکه 6 گونه از آنها براي نخستين بار ازآن کشور گزارش مي شد،درآن بين گونه هاي Meloidogyne بيشترين تراکم جمعيتي را بر روي سبزيجات و خيار دارا بود.
در سال 2005 ، کرجه و همکاران، نژاد 2 نماتد ريشه گرهي Meloidogyne arenaria را در اردن از روي خيار، گوجه فرنگي، کدو و لوبيا جمع آوري و گزارش نمودند.
باروتي در سال 1376 در بررسي فون نماتدهاي انگل گياهي خاک هاي زراعي آذربايجان شرقي ، اردبيل و مغان ، گونه M. javanica را از روي خيار ، گوجه فرنگي ، يونجه و بارهنگ و سيب زميني در مناطق ذکر شده جدا کرد.
در سال 1382 مهديخاني مقدم و همکاران در بررسي و شناسايي گونه هاي جنس Meloidogyne در ايران، گونه Meloidogyne javanica را از روي ريشه هاي گوجه فرنگي و ساير گياهان در مناطق مختلف ايران گزارش نمودند
در سال 1385 پاک نيت گونه هاي نماتد ريشه گرهي (Meloidogyne spp. ) را در تعدادي از گلخانه ها و مزارع کدوييان و گوجه فرنگي بررسي و بيان کردند که 4/76 درصد نمونه ها آلوده به جمعيت مخلوط M. javanica و M. incognita و حدود 5/17 درصد آلوده به M. javanica و 6 درصد آلوده به M. incognita بودند. در سال 1386 مهديخاني مقدم و همکاران گونه Meloidogyne javanica را از روي خيار از منطقه هاي اروميه- بادرلو، بيرجند، سبزوار، کرج- سرحدآباد و هشتگرد جمع آوري و شناسايي کردند و جمعيت هاي مختلف اين گونه را از نظر چند شکلي آنزيمي در رابطه با آنزيم هاي استراز، مالات دهيدروژناز و سوپر اکسيد ديسموتاز مورد بررسي قرار دادند.
کريمي پور و همکاران طي سال هاي 1387-1385 در بررسي مقادير مختلف کود مرغي و تلفيق آن با شخم تابستانه در کنترل نماتد ريشه گرهي در 2 محصول طالبي و خربزه در اصفهان دريافتند که اين روش بهترين تاثير را در کنترل نماتد و افزايش هر دو محصول دانسته و جهت کاهش خسارت ناشي از حمله اين نماتد نسبت به تيمار شاهد در اولويت هستند.
به منظور شناسايي نماتدهاي انگل گياهي مزارع و گلخانه هاي خيار در منطقه جيرفت وکهنوج،رفيعي و همکاران درسال 1386 تعداد 16 گونه نماتد متعلق به 13 جنس را گزارش کردند که از بين آنها گونه هاي Aphelechus isomerus و Ditylenchus longimatricalis و Ektaphelenchoides compsi براي اولين بار از ايران گزارش شدند.
ابولي پور وهمکاران نيز در سال 1387 در بررسي تاثير نماتد ريشه گرهي بر گلدهي و ماندگاري خيار گلخانه اي و محلي دريافت که رقم دستگردي که رقم مزرعه اي مي باشد متحمل ترين رقم نسبت به نماتد ريشه گرهي Meloidogyne javanica ميباشد. همجنين آنها در ارزيابي ارقام گلخانه اي خيار نسبت به اين نماتد به حساسيت تمام ارقام رايج گلخانه اي پي برده و دو رقم محلي دستگردي و چمبر رامتحمل شناختند.
در سال 1384 جباري و همکاران در بررسي فون نماتدهاي سبزيجات اطراف تبريز گونه هاي Filenchus vulgaris و Heterodera cruciferae را از خاک اطراف ريشه هاي کدو و ساير سبزيجات جداسازي کردند.

فصل سوم
مواد و روش ها

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

3-1- نمونه برداري
به منظور شناسايي نماتد هاي انگل گياهي مزارع کدوئيان استان خراسان رضوي، طي سال هاي 88 و 89 تعداد 56 نمونه خاک و ريشه و همچنين تعداد16نمونه مربوط به نماتدهاي ريشه گرهي از مزارع کدوئيان استان جمع آوري گرديد. نمونه برداري بسته به نوع مزرعه به حرکت در طول دو قطر مزرعه يا به صورت مارپيچي يا زيگزاکي انجام شد. بدين منظور، در طول مسير حرکت به فواصل هر 5 تا 10 متر يک نمونه از منطقه اطراف ريشه (عمق 10 تا 30) سانتي متري برداشته و در پايان بعد از مخلوط نمودن تمام نمونه هاي يک مزرعه، يک نمونه يک کيلويي (همراه با ريشه هاي آلوده) که نماينده کل مزرعه است، انتخاب و در کيسه پلاستيکي قرار داده شد. سپس نمونه ها به آزمايشگاه تحقيقات بيماري هاي گياهي منتقل و در يخچال در دماي 4 درجه سانتي گراد نگهداري شدند. بخشي از ريشه هاي آلوده جهت استخراج ماده هاي بالغ جنس Meloidogyne و تهيه برش از انتهاي بدن آنها به طور جداگانه در محلول فرمالين 5 درصد نگه داري شد.مشخصات نمونه هاي خاک جمع آوري شده از هر ناحيه از منطقه خراسان رضوي و نقشه علامت گذاري شده توسط دستگاه GPS در زير آورده شده است:
جدول3-1: مکان، زمان و نوع آبياري در نمونه هاي خاک جمع آوري شده
رديفزمان نمونه برداريمکان نمونه بردارينوع آبياريرديفزمان نمونه برداريمکان نمونه برداري
نوع آبياري1مرداد88خواجه ربيعغرقابي28تير 89کاشمر(قلعه بالا)غرقابي2مرداد88خواجه ربيعغرقابي29تير 89کاشمر(قلعه بالا)غرقابي3مرداد88کلات (سولاخه)غرقابي30تير 89کاشمر(قلعه بالا)غرقابي4مرداد88کاردهغرقابي31تير 89کاشمر(فيض آباد)غرقابي5مرداد88کاردهغرقابي32تير 89کاشمر(فيض آباد)غرقابي6مرداد88نيشابور(باغشن)غرقابي33تير 89کاشمر(تربقان)غرقابي7مرداد88نيشابور(باغشن)غرقابي34تير 89کاشمر(تربقان)غرقابي8مرداد88سبزوار(ده نوي)غرقابي35تير 89کاشمر(ريوش)غرقابي9مرداد88سبزوار(ده نوي)غرقابي36مرداد90تربت جامغرقابي10مرداد88نيشابور(ميرآباد)غرقابي37مرداد89تربت جامغرقابي11مرداد88نيشابور(بلغشه)غرقابي38مرداد89کاشمر(عطائيه)غرقابي12مرداد88نيشابور(بلغشه)غرقابي39مرداد89نيشابور(قاسم آباد)غرقابي13مرداد88نيشابور(کارجيج)غرقابي40مرداد89نيشابور(رئيسي)غرقابي14مرداد88نيشابور(اسلاميه)غرقابي41مرداد89نيشابور(رئيسي)غرقابي15مرداد88قوچان(کلاته يزديها)غرقابي42مرداد89سرخسغرقابي16شهريور 88قوچان(کلاته يزديها)غرقابي43مرداد89سرخسغرقابي17شهريور 88قوچان(نوري)غرقابي44مرداد89سرخسغرقابي18شهريور 88قوچان(نوري)غرقابي45شهريور89جيم آبادغرقابي19شهريور 88قوچان(امرغان)غرقابي46شهريور89جيم آبادغرقابي20شهريور 88قوچان(امرغان)غرقابي47شهريور89جيم آبادغرقابي21شهريور 88قوچان(امرغان)غرقابي48شهريور89جيم آبادغرقابي22شهريور 88چناران(کمبلان)غرقابي49شهريور89جيم آبادغرقابي23شهريور 88چناران(کمبلان)غرقابي50شهريور89فريمانغرقابي24شهريور 88کاظم آبادغرقابي51شهريور89فريمانغرقابي25شهريور 88کاظم آبادغرقابي52ارديبهشت90کاشمر(قلعه بالا)غرقابي26شهريور 88بزرگراه باغچهغرقابي53ارديبهشت90حصار سرخغرقابي27شهريور 88بزرگراه باغچهغرقابي54ارديبهشت90حصار سرخغرقابي
شکل 3-1: نقشه مکان هاي نمونه برداري
3-2- استخراج نماتدها
3-2-1- استخراج نماتدهاي کرمي شکل از خاک
جهت استخراج نماتدها از خاک، روش تکميل شده دگريس (1969) و تغيير يافته جن کينز (1964) مورد استفاده قرار گرفت. مقدارk 250 تا 300 گرم از نمونه خاک را داخل يک سطل ريخته، بعد از اضافه کردن مقدار کافي آب، آنرا با دست خوب بهم زده تا مخلوط شود. جهت ته نشين شدن املاح سنگين، محلول حدود 10 تا 15 ثانيه به حال خود رها شده، سپس به آرامي به سطل ديگري منتقل شد. در اين عمل بايد دقت کرد که گل و املاح ته نشين شده در ته سطل اول به داخل سطل بعدي سرازير نشود. عمل شست و شوي خاک ته سطل اول به همين ترتيب سه بار تکرار گرديد و در نهايت آب حاصل از کل شست و شو در يک سطل جمع آوري شد. جهت صاف کردن سوسپانسيون فوق، ابتدا از يک الک با سوراخ هاي به قطر 1 ميليمتر، سپس از الک هايي با سوراخ هايي به قطر 250 ميکرومتر (60 مش)، 150 ميکرومتر(100 مش) و 38 ميکرومتر(400 مش) عبور داده شد. سپس محتويات سطح الک ها به يک مزور يک ليتري منتقل گرديد و براي اينکه محلول بيشتر صاف شود، حدود نيم تا يک ساعت به حال خود رها شد. در اين مدت نماتدها ته نشين شده، بقاياي گياهي و ساير مواد زائد در سطح آب جمع و به طريقي از سطح آب خارج شدند. سپس متناسب با حجم لوله‌هاي سانتريفيوژ مقداري از آب مزور را تخليه کرده و املاح ته نشين شده را به همراه مقدار کم آب بهم زده، به مقدار و وزن مساوي در لوله هاي سانتريفيوژ تقسيم گرديد و لوله ها درون سانتريفيوژ قرار داده شد. محتوي داخل لوله ها در دو مرحله سانتريفيوژ رسوب کردند. در مرحله اول آب رويي دور ريخته شد. در مرحله دوم سانتريفيوژ، از محلول شکر استفاده شد. بدين ترتيب بعد از اضافه شدن محلول شکر به لوله هاي حاوي رسوب حاصل از سانتريفيوژ اول، محتويات لوله ها با کمک ميله شيشه اي به آرامي همزده شد و لوله ها داخل سانتريفيوژ قرار گرفت و به مدت 1 دقيقه با سرعت 1000 دور در دقيقه سانتريفيوژ انجام شد. در اين عمل ذرات خاک ته نشين شده و نماتدها در محلول شکر به صورت شناور باقي مي مانند. بعد از اتمام سانتريفيوژ بلافاصله محلول رويي لوله ها در زير جريان ملايم آب روي سطح الک 38 ميکرومتري ريخته شد. سپس سطح الک توسط مقداري آب به داخل يک پتري ديش کوچک شسته شد با اين عمل نماتدهاي نمونه خاک به همراه کمي خاشاک و جانوران ريز و تخم نماتدها استخراج شد. براي تهيه 1 ليتر محلول شکر با وزن مخصوصgr/cm3 18/1، مقدار 454گرم شکر را در مقداري آب حل کرده و به حجم يک ليتر رسانده شد.
جدول 3-2: مشخصات ريشه هاي آلوده به نماتد Meloidogyneجمع آوري شده
رديفزمان نمونه برداريمکان نمونه بردارينوع آبياريرديفزمان نمونه برداريمکان نمونه بردارينوع آبياري1شهريور 88قوچان(امرغان)غرقابي5شهريور 88جيم آبادغرقابي2شهريور 88قوچان(امرغان)غرقابي6شهريور 88جيم آبادغرقابي3شهريور 88قوچان(امرغان)غرقابي7شهريور 88جيم آبادغرقابي4شهريور 88قوچان(امرغان)غرقابي8شهريور 88جيم آبادغرقابي3-3- استخراج ماده هاي متورم جنس Meloidogyne از ريشه
نماتدهاي ماده متورم به تنهايي يا به صورت چند تايي در داخل بافت ريشه قرار دارند. براي استخراج آنها از بافت گياهي، ريشه هاي حاوي گره را در زير جريان ملايم آب قرار داده تا ذرات خاک از آنها شسته شود وسپس به قطعات 3 تا 5 سانتي متري برش داده و در داخل يک ظرف حاوي مقداري آب قرار داده، سپس در زير بينوکولار با استفاده از اسکالپل با دقت بافت ريشه را شکافته و با احتياط ماده هاي متورم از داخل بافت بيرون کشيده شدند. پس از جدا کردن تعداد کافي نماتد، از شبکه کوتيکولي انتهاي بدن1 آنها برش تهيه شد.
3-4- کشتن، ثابت کردن و انتقال نماتدها به گليسيرين خالص
پس از استخراج نماتدها به منظور نگه داري آنها در دراز مدت لازم است عملياتي در جهت کشتن، ثابت کردن و انتقال آنها به گليسيرين خالص انجام شود. بدين منظور از روش تکميل شده دگريس(1969) استفاده شد. نماتدهاي استخراج شده به داخل يک پتري کوچک انتقال يافته، جهت کشتن و ثابت کردن آنها ابتدا آب ظرف حاوي نماتد تخليه گرديد. اين کار توسط يک پيپت پاستور بسيار نازک در زير بينوکولار و با دقت به طوريکه نماتد ها مکيده و دور ريخته نشود، انجام گرفت ودر مواردي نيز با استفاده از نوارهاي باريک دستمال کاغذي (که يک سر آن داخل پتري و سر ديگرش خارج از پتري است) عمل آبگيري انجام شد. پس از خروج آب از پتري حاوي نماتد ، محلول فيکساتيو 1 (88 قسمت آب مقطر، 10 قسمت فرمالدهيد 37 درصد تجاري، 1 قسمت اسيد استيک و يک قسمت گليسيرين) را تا 78 درجه سانتي گراد گرم کرده و يکباره روي نماتد هاي داخل پتري ريخته، سپس پتري را به مدت 24 ساعت در محيط الکلي اشباع (اين محيط با استفاده از دسيکاتور کوچکي که به اندازه 1/0 حجم اش الکل اتيليک 96 درصد داخل آن ريخته شده فراهم گرديد) داخل انکوباتور با حرارت 37 درجه سانتيگراد قرار داده شد. بعد از گذشت مدت زمان مذکور محلول فيکساتيو 1 خارج و محلول فيکساتيو 2 (95 قسمت الکل اتيليک 96 درصد و 5 قسمت گليسيرين ) به پتري حاوي نماتد اضافه گرديد، سپس به مدت 4 ساعت در محيط الکلي اشباع در دماي 37 درجه سانتيگراد قرار گرفت. مجددا بعد از گذشت مدت زمان مذکور و پس از خارج کردن فيکساتيو 2 ، محلول فيکساتيو 3 (50 قسمت الکل و 50 قسمت گليسيرين ) به پتري اضافه شد. اين بار پتري حاوي نماتد در صفحه درون انکوباتور در محيط غير الکلي به مدت حداقل 4 ساعت در حرارت 37 درجه سانتيگراد قرار داده شد. پس از طي شدن تمام مراحل فيکساتيو جهت جلوگيري از جذب رطوبت، پتري حاوي نماتد در دسيکاتور حاوي کلرور کلسيم نگهداري شد.


دیدگاهتان را بنویسید