(1-14-1 جداسازي و خصوصيات اوليه پاراکوويروس ………………………………………………………………………………………………………. 33
(2-14-1 پروتئين هاي پاراکوويروس ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 34
(3-14-1 پردازش پروتئين در پاراکوويروس ها ………………………………………………………………………………………………………………… 35
(4-14-1 توالي 5´-UTR در پاراکوويروس ها ………………………………………………………………………………………………………………….. 36
(5-14-1 ارتباط ژنتيکي پاراکوويروس ها با پيکورنا ويروس هاي ديگر …………………………………………………………………………… 38
(6-14-1 تداخلات بين HPeV1-2 با سطح سلولهاي حساس ………………………………………………………………………………………39
(7-14-1 عوارض کلينيکي و اپيدوميولوژي پاراکوويروس ها ……………………………………………………………………………………………. 41
(8-14-1 ويروس هاي مرتبط با پاراکوويروس ها در حيوانات …………………………………………………………………………………………. 41
جداول:
جدول 1) اعضاي خانواده پيکورنا ويريده ………………………………………………………………………………………………………………………….. 4
جدول 2) گيرنده ها و کمک گيرنده هاي مورد استفاده در پيکورنا ويروس …………………………………………………………………… 19
جدول 3) ميزان تشابه توالي اسيدهاي آمينه بينHPEV-1 وHPEV-2 …………………………………………………………..43…….
جدول 4) تهيه محيط کشت………………………………………………………………………………………………………………………………………………..55
جدول 5) تهيه محلول هاي مورد نياز براي استخراج پلاسميد…………………………………………………………………………………………….57
جدول 6) توالي و موقعيت پرايمرهاي طراحي شده براي ناحيه5´ UTR ……………………………………………………………………….. 59
جدول 7) نتيجه مقايسه سکانس توالي هاي 5UTR با بانک ژني به روش blast…………………………………………………………………. 65
جدول 8 )نتايج blast محصول PCR ………………………………………………………………………………………. …………………………………………….73
جدول 9- فراواني نمونه هاي مثبت پاراکوويروس هاي انساني کودکان مبتلا به گاستروآنتريت بر اساس PCR……………….76
جدول10 – فراواني نمونه هاي مثبت پاراکوويروس هاي انساني کودکان مبتلا به گاستروآنتريت برحسب جنس…………….76
جدول11- فراواني نمونه هاي مثبت پاراکوويروس هاي انساني کودکان مبتلا به گاستروآنتريت برحسب سن…………………76
جدول 12- فراواني نمونه هاي مثبت پاراکوويروس هاي انساني کودکان مبتلا به گاستروآنتريت برحسب فصل………………76
نمودار:
نمودار1- فراواني نمونه هاي مثبت پاراکوويروس هاي انساني کودکان مبتلا به گاستروآنتريت بر اساس PCR………………77
نمودار-2 فراواني نمونه هاي مثبت پاراکوويروس هاي انساني کودکان مبتلا به گاستروآنتريت برحسب جنس………………77
نمودار-3 فراواني نمونه هاي مثبت پاراکوويروس هاي انساني کودکان مبتلا به گاستروآنتريت برحسب سن……………….78.
نمودار4 – فراواني نمونه هاي مثبت پاراکوويروس هاي انساني کودکان مبتلا به گاستروآنتريت برحسب فصل……………..78
اشکال:
شکل 1) نماي شماتيک کپسيد ويروس ها ………………………………………………………………………………………………………………………. 9…..
شکل 2) دياگرام شماتيک 8 زنجيره ? ………………………………………………….. ……………………………………………………. 11
شکل 3) مدلي از پوليوويروس تيپ 1 ……………………………………………………………………….. ………………………… 11
شکل 4) تداخلات ميريستات با پروتئين هاي سطح ويروس …………………………………………………………………………………………….. 13
شکل 5) تصوير شماتيک ژنوم پيکورنا ويروس ها ……………………………………………………………………………………………………………….. 13
شکل 6) دو تيپ اصلي از IRES در پيکورنا ويروس ها ……………………………………………………………………………………………………… 15
شکل 7) چرخه تکثير پيکورناويروس …………………………………………………………………………………………………………………………………… 17
شکل 8) تصوير شماتيکي از Canyon …………………………………………………………………… …… …………………….20
شکل 9) شکاف Canyon و نحوه قرار گرفتن دارو در VP1 ……………………………………………………………………………………………… 20
شکل 10) مدل دخول پيکورنا ويروسها به درون سلول ………………………………………………………………………………………………………. 22
شکل 11) مکانيسم فرضي براي عبور RNA پيکورنا ويروس ها از عرض غشا ……………………………………………………………….. 22
شکل 12) تصوير سه بعدي از 3C pro ويروس هپاتيت A ، 2A pro رينو ويروس و FMDV Lpro …………………………… 25…..
شکل 13) نحوه اتصال vpg به ابتداي ژنوم پيکورنا ويروسها، محل کليواژ vpg………………………………………………………….. 29……
شکل 14) سنتز RNA و ترجمه پروتئين …………………………………………………………………… ………………………………………………….. 30
شکل 15) مدل سنتز ssRNA پولوويروس ……………………………………………………………………………………………………………………… 31
شکل 16) مراحل ساخته شدن واحدهاي ساختماني و عملکرد 3CD pro در اين مرحله ……………………………………………….. 32
شکل 17) مراحل مرفوژنز پيکورنا ويرس ها ……………………………………………………………………………………………………………………… 33
شکل 18) کليواژ اوليه پروتئين پيکورنا ويروس ها …………………………………………………………………………………………………………… 36
شکل 19) دياگرام شماتيک ساختار ثانويه ………………………………………………………………………………………………………………………… 37
شکل 20) دندروگرافي براساس پروتئين VP3 در پيکورنا ويروس ها ……………………………………………………………………………… 38
شکل 21) مقايسه توالي اسيد آمينه اي در انتهاي کربوسيلي از VP1 در بين پاراکوويروس ها و CAV ………………………. 39.
شکل 22) نتايج Plaque assay پاراکوويروس انساني تيپ 1 ……………………………………………………………………………………….. 40
شکل 23) ارتباط فيلوژنيک بين پاراکوويروس ها و ايزوله هاي تازه جداشده از ويروس L jungan درحيوانات……………..42
فصل اول
کليات………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….44
بيان مساله…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..45
(2-1 فرضيه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………46 . (3-1اهداف تحقيق…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 47
1-4)ضرورت انجام تحقيق………………………………………………………………………………………………………………………………………………………47

فصل دوم
مروري بر متون گذشته………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….48
فصل سوم
مواد و روش ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….51
(1-3آماده سازي ميكروتيوب و سرسمپلرها…………………………………………………………………………………………………………………………52
(2-3 مواد لازم براي تهيه سوسپانسيون ……………………………………………………………………………………………………………………………..52
(3-3 جداسازي RNA و ساخت cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………….53
(4-3سنتز cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
3-5) Compatent……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….55
3-6) ترا نسفورم………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………56
Mini prep protocol ( 7-3 (استخراج پلاسميد)……………………………………………………………………………………………………………58
PCR (8-3……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..58
(9-3 روش تهيه ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………60
(10-3 روش آماده سازي مارکر 1kb……………………………………………………………………………………………………………………………………60

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

11-3)تکنيک الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..61
(12-3تهيه بافر الكتروفورز 1x………………………………………………………………………………………………………………………………………………61
(13-3روش استخراج DNA‌از ژل …………………………………………………………………………………………………………………………………….61
فصل چهارم
نتايج…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….63
مقايسه blast برخي توالي هاي مثبت با توالي موجود در بانک ژني…………………………………………………………………………………..66
فصل پنجم
بحث و نتيجه گيري…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..79
بحث………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….80
نتيجه گيري………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………84
توصيه ها و پيشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………………………..85
منابع………………………………………………………………………………………………………………………………………………..86
خلاصه انگليسي…………………………………………………………………………………………………………………………….100.
اختصارات:
+ssRNA:plus sense single stranded RNA
EMCV:Encephalomyocarditis virus
FMDV:Foot and mouth disease virus
HPEV1,2:Human parechovirus type 1 and 2
cDNA:Complementary DNA
PCR:Polymerase chain reaction
HAV:Hepatitis A virus
CPE:Cytopathic effect
ICAM-1:Intercellular adhesion molecule -1
VPG:Viral protein genome linked
mRNA:Messenger RNA
IRES:Internal ribosome entry site
ORE:Open reading frame
PVR:Poliovirus receptor
RE:Restriction enzyme
RI:Replication intermediate
RF: Replication form
IPTG:Isopropyl-?-D-thiogalactoside
DAF:Decay-accelerating factor
WHO:World health organization

خلاصه:
پار اکو ويروس انساني که به خانواده پيکورنا ويروس ها تعلق دارد, بدون غشا بوده و داراي ژنوم RNAتک رشته با قطبيت مثبت مي باشد . اندازه ژنوم اين ويروسKb 4/8 – 2 /7مي باشد. اين ويروس با بروز عفونت هاي گوارشي و تنفسي و گاهي عفونت هاي سيستم اعصاب مرکزي مرتبط است. از آنجا يي که هيچ اطلاعات درستي در مورد ژنوتايپ اين ويروس در ايران وجود نداشته است اين مطالعه به منظور تشخيص سريع , تعيين ژنوتايپ اين ويروس در نمونه هاي مدفوع کودکان ايراني زير چهار سال مبتلا به گاستروآنتريت طراحي شده است. RNA از سوسپانسيون مدفوع استخراج شده وcDNA تهيه گرديد و nested PCR با پرايمرهاي اختصاصي انجام شد و محصول PCRاز ژل آگارز استخراج و تعيين توالي گرديد . نتايج نشان داد که تکنيک RT-PCR براي تشخيص مستقيم HPeV در نمونه هاي کلينيکي کاربردي تر, حساس تر , سريعتر از روش کشت سلولي مي باشد. اين موضوع تاييد ميکند که روش RT-PCR روشي برتر براي تشخيص اين ويروس درزماني کوتاهتر و با هزينه کمتر مي باشد. همچنين تشخيص سريع مي تواند مانع مصرف بي رويه آنتي بيوتيک گردد.
کلمات کليدي : پيکورناويروس- پاراکوويروس انساني- گاستروآنتريت

مقدمه

1-1 )تاريخچه پيکورنا ويروس:
پيکورنا ويروس ها دليل نام آنها کوچکي آنهاست که پيکو(Pico) به زبان آلماني به معناي کوچک است يعني ويروسهاي کوچک RNA دار, و پاراکوويروس از خانواده پيکورنا ويروس ها مي باشد.
پيکورنا ويروس ها، ويروس هاي کروي شکلي هستند که داراي ژنوم RNA ي تک زنجيره با قطبيت مثبت (+ssRNA) مي باشند.اندازه اين ويروس ها از kb 7.2 در (رديف ويروس انساني) تا Kb 7.4 در (پوليوويروس، هپاتيتA) و تا kb8.4 در (آفتو ويروس ها) متغير است (1).
پيکورنا ويروس ها نقش شگرفي در پيشرفت ويروس شناسي مدرن داشته اند، به طوريکه FMDV1 اولين ويروس حيواني بود که در سال 1898 توسط Frosch , Loeffler کشف گرديده. ده سال بعد در اواخر قرن بيستم، با ظهور اپيدمي پوليوميليت شاهد ايزوله شدن عامل اين عفونت (پوليوويروس) توسط popper , landsteinerk بوديم. 40سال بعد دريافتند که پوليوويروس قادر است در کشت سلولي رشد نمايد. اين يافته آغاز راهي براي مطالعه تکثير ويروسها بود. سپس اندازه گيري پلاک (Plaque assay) به عنوان يک روش استاندارد در اندازه گيري عفونت زايي پوليوويروس به کار گرفته شد (3,2).
اولين RNA پليمراز مرتبط با RNA در مننگوويروس (Mengovirus) شناسايي گرديد (1) .
با انجام مطالعات بيشتر مشخص شد که ويروس ها براي ورود به سلول از يکسري گيرنده هاي خاص استفاده مي کنند که مختص آن ويروس ها بوده و براي ورود ويروس به سلول ضروري مي باشند.
پروتئين هاي پيکورنا ويروس ها به صورت يک پارچه سنتز شده و توسط يک يا دو پروتئين که خاصيت پروتئازي دارند بصورت آبشاري ودنبال هم مي شکند و بسته به نوع ويروس12,11,10 پروتئين مجزا دارند. اين پيش سازهاي پروتئيني شامل2A , 3C , 3D است که نقش مهمي در همانندسازي و تکثير ويروس دارند. به طورکلي اين پروتئين ها غير ساختماني بوده. و فعاليتهاي آنزيمي او شبه آنزيمي دارند.
بسياري از پيکورنا ويروسها بيماريهاي مختلفي در انسان ايجاد مي کنند. از فلج شديد تا مننژيت اسپتيک، ميوکارديت، ضايعات وزيکولر و گزانتمي پوستي، ضايعات جلدي مخاطي، بيماري هاي تنفسي، بيماري هاي چشمي و… جدي ترين بيماري که توسط پيکورنا ويروس ها در انسان به وجود مي آيد پوليوميليت است که اشکال تحت باليني اين بيماري از بيمارهاي باليني آن شايع تر مي باشد (1).
1-2) تقسيم بندي پيكورناويروس ها :
اين ويروس ها بر اساس خصوصيات فيزيکي، دانسيته شناوري، حساسيت به PH ، نزديکي سرولوژيکي و اکنون بيشتر براساس خصوصيات مولکولي تقسيم بندي شده اند. براساس تجديد نظر جديد توکسونومي به 9 جنس تقيسم شده اند که البته هر جنس هم شامل زير گروه هايي مي شود (2). (جدول شماره يک)
جدول 1 )- اعضاي خانواده پيکورنا ويريده.
Members of the Family PicornaviridaeSpeciesAphtovirusFoot – and – mouth disease virus
Equine rhinitis A virus
Equine rhinitis B virus
AvihepatovirusDuck hepatitis A virusCardiovirusEncephalomycarditis virus
TheilovirusEnterovirusBovine enterovirus
Human enterovirus A
(Coxsackievirus,enterovirus)
Human enterovirus B
(Coxsackievirus,echovirus,enterovirus)
Human enterovirus C
(poliovirus,coxsackievirus,enterovirus)
Human enterovirus D
(enterovirus)
Porcine enterovirus B
Simian enterovirus A
Human rhinovirus A
Human rhinovirus B
Human rhinovirus CErbovirusEquine rhinitis B virusHepatovirusHepatitis A virusKobuvirusAichi virus
Bovine kobuvirus
ParechovirusHuman parechovirus
Ljungan virusSepelovirusPorcine sapelovirus
Simian sapelovirus
Avian sapelovirus
SenecavirusSeneca valley virusTremovirusAvian encephalomyelitis virusTeschovirusPorcine teschovirusRefrance: Fields, B., 2013, Virology book, Vol .13
I) آفتوويروسها :
مهمترين ويروس اين خانواده FMDV مي باشد که حيوانات سم دار نظير گاو، بز، گوسفند و خوک را آلوده ميکند.و بندرت انسانها را نيز آلوده مي نمايد. هفت سروتيپ از آفتوويروسها شناسايي شده است(سروتيپAsial , SAT 1,2,3 , C , A , O ). در بين هر سروتيپ، زيرگروه هاي زيادي وجود دارد. اين ويروس ها خيلي حساس هستند و عفونت زايي آنها در PH کمتر از 7 کاهش مي يابد( 1و9و8).
II) کارديو ويروس ها :
داراي دو شاخه مستقل است.
الف : ويروس هاي شبه انسفالوميوکارديت که شامل انسفالوميوکارديت ويروس و کلمبيا ويروس SK و مننگوويروس است. که ويروس هاي پاتوژن در موش هستند, البته مي توانند در انسان، ميمون، خوک، فيل، سنجاب هم بيماري بدهند.
ب : در اين گروه ويروس هايي هستند که در سيستم عصبي توليد بيماري مي کنند و شامل طيف و سيعي از ويروس ها هستند که شاخص آنها Theleris murin encephalomyelitis viruse مي باشد. (5)
III) هپاتوويروسها :
ويروس هپاتيت A (HAV) که قبلاً عضوي از جنس انتر و ويروسها بود اکنون در جنس مجزايي به نام هپاتوويروس قرار گرفته است دليل اين طبقه بندي مجدد خصوصيات ويژه مولکولي HAV مي باشد.
توالي نوکلئوتيدي و اسيدآمينه اي HAV با پيکورنا ويروس هاي ديگر تشابه کمي دارد.
تکثير آن در کشت سلولي بدون ايجاد CPE مي باشد و انتقال بيماري مدفوع- دهاني و عامل هپاتيت مي شود(1و6و7و8).
IV) رينوويروس ها :
علت نامگذاري اين ويروس ها به محل رشد و تکثير آنها يعني نازوفارنکس مربوط مي شود اين گروه متداول ترين عوامل سرماخوردگي در کودکان و بزرگسالان هستند. اين جنس داراي اعضاي بسيار زيادي است که سه تيپ و 103 سروتيپ دارد.
اين ويروس به محيط اسيدي حساس بوده و در دستگاه تنفسي قدرت رشد دارند و اين خاصيت آنها را از انتروويروس ها متمايز مي گرداند (1و 2).
V)انتروويروسها :
اين ويروسها در دستگاه گوارش تکثير مي شوند و به PH اسيدي معده مقاوم هستند. اين جنس در بر گيرنده پوليوويروس2 (3 سروتيپ)، کوکساکي ويروس3(23سروتيپ)، اکوويروس4(28 سروتيپ)، انتروويروس هاي انساني(4 سروتيپ) و شماري از ويروسهاي غيرانساني مي باشد.
V-1/پوليوويروس ها :
قديمي ترين ويروس شناخته شده است که شامل سه سروتيپ مجزا مي باشد و سبب بيماري فلج مي گردد. راه ورود ويروس مدفوعي- دهاني مي باشد. ويروس بيشتر به سلول هاي لنفوئيدي اپي تليال و نرون ها در سيستم عصبي مرکزي تمايل دارد. ايمني نسبت به ويروس پوليو دائمي و جلوگيري از عفونت وابسته به واکسيناسيون است و گيرنده اختصاصي ويروس پوليو ، CD155 مي باشد (1 و 2).
V-2/ اکو ويروس ها :
دليل نامگذاري اين است که ايجاد بيماري مشخص نمي کند و اولين بار از مدفوع جدا شده و بيشتر از 32 سروتيپ از آن شناخته شده است. بيماري هايي که ايجاد مي کند مننژيت غير چرکي، انسفاليت، بيماري تب دار و سرماخوردگي است و در انسان هم سبب اگلوتيناسيون اريتروسيت هاي گروهO مي شود (1 و 4).
V-3 / کوکساکي ويروس ها :
براساس ايجاد بيماري در نوزاد موش شيرخوار به 2 گروه A , B تقسيم بندي شده اند.
گروهA : سبب بيماري فارنژيت و زيکولي، التهاب خونريزي دهنده چشم و … مي شوند.
گروهB : سبب ميوکارديت، پريکارديت، انسفاليت و پلاک هاي فاسد شونده در ماهيچه و مغز مي شوند و راه ورود ويروس دهاني مي باشد (1).
اين ويروس ها از رسپتورهاي مختلف مانند vitronecti receptor , I-Cam1 , CD55 جهت اتصال به سلول استفاده مي کنند.(2)
VI) پاراکوويروس ها :
اين جنس به تازگي طبقه بندي شده است و شامل 2 سروتيپ 5پاراکوويروس انساني تيپ 1 و 2 است. اين دو ويروس قبلاً به عنوان اکوويروس تيپ 22 و 23که جز گروه انتروويروسها طبقه بندي شده بودند. پس از مطالعه مولکولي ژنوم اين ويروس ها مشخص گرديد که اين دو ويروس تنها 30% با پيکورناويروس هاي ديگر تشابه اسيد آمينه اي دارند. از طرف ديگر کپسيداين ويروس ها تنها سه پروتئين دارد و کليواژ (cleavage) پپتيد VPO به VP2 و4VP صورت نمي گيرد. اين موضوع منجر به طبقه بندي مجدد اين ويروس ها و قرار دادن آنها در جنس جداگانه اي به نام پاراکوويروس گرديد. (10)
1-3) خصوصيات فيزيکي و شيميايي پيکورنا ويروس ها:
1-3-1)حساسيت به PHاسيدي :
انترو ويروسها ، هپاتوويروسها، کارديوويروسها و پاراکو ويروسها به اسيد معده مقاومند و عفونت زايي آنها در PHکمتر از 3 از بين نمي رود. در صورتيکه رينوويروسها و آفتوويروسها بهPH کمتر از 6 حساس اند به همين دليل محل طبيعي تکثير اين ويروسها در بدن متفاوتند. از طرف ديگر حساس بودن رينوويروسها و آفتوويروسها به PHاسيدي در مرحلة پوشش برداري (Uncoating) نقش دارد (2).
1-3-2)دانسيته:

کارديو و آنتروويروس دانسيته 34/1 گرم در ميلي ليتر در کلريد سزيم دارند و FMDV دانسيته 45/1 گرم در ميلي ليتر در کلريد سزيم دارد. رينوويروس دانسيته 40/1 گرم در ميلي ليتر در کلريد سزيم دارد که دليل اين اختلاف حرکت نفوذپذيري کپسيدويروس نسبت به سزيم است. کپسيدپوليو نسبت به سزيم غير قابل نفوذ است و ويروس در چگالي شناوري سبک تري باند مي شود ولي کپسيدآفتوويروسها منافذي دارد که سزيم مي تواند به درون ويريون نفوذ نمايد (11و 12و 13).
(3-3-1حساسيت نسبت به حلال هاي ليپيدي:
پيکورنا ويروس فاقد پوشش ليپيدي است و به کلروفرم، دتر جنت واتر مقاوم بوده و از بين نمي رود (6 و 14).
1-4) ساختمان پيکورناويروس:
(1-4-1کپسيد:
کپسيد از چهار پروتئين ساختماني به نام vp1 ، vp2 ، vp3 ، vp4 ، تشکيل شده است. ولي در ميان اعضاي پاراکوويروس ها استثناء مي باشند. زيرا که کپسيد آن ها تنها داراي سه پروتئين VPO ، VP2 و VP4 مي باشد و کليواژهايVPO، به VP2وVP4انجام نميشود (10).
در سال 1960 دو دانشمند به نام casper and klug مبناي ساختماني ويروسها را تشريح کردند و نشان دادند که کپسيد اين ويروسها داراي ساختمان ايکوزاهدرال (Icosahedral )، تقارن بيست وجهي است که از چهار پروتئين VP4 – VP1 تشکيل شده (به استثناي پاراکوويروس) (14). يک 20 وجهي از 20 مثلث متساوي الاضلاع و 12 گوشه تشکيل يافته است (شکل 1 ). نتايج حاصل از مطالعات اشعه X و بررسي هاي بيوشيميايي نشان داد که کپسيد پيکورنا ويروسها واجد 60 پروتئين ساختماني است که به صورت يک شبکه 20 وجهي استوار يافته اند. در سال 1985 ساختار اتمي پوليوويروس و رينوويروس انساني تيپ 14 به کمک کريستالوگرافي با اشعه Xمشخص گرديد (15و14).

شکل 1- نماي شماتيک کپسيد ويروسها.در اين شکل حالت 20 وجهي، پروتومرها و پپتيدهاي شکل دهنده کپسيد مشخص مي باشد.شکاف کانيون (Canyon) نيز در گوشه سمت راست مشخص مي باشد.
اصلي ترين جزء سازنده در کپسيد پيکورنا ويروسها را پروتومر (protomer) ناميدند. هر پروتومر از 4 پروتئين VP4-VP1 تشکيل شده است. سه پروتئين VP1، VP2 ، VP3 در سطح خارجي کپسيد قرار دارند ولي VP4در سطح داخلي کپسيد و در تماس با ژنوم قرار دارد. اين پروتئين ها با هم شبکه اي استوانه اي را تشکيل داده که از 8 رشته زنجيره موازي و در خلاف جهت هم قرار دارند و به نام -barreljellyroll? مي نامند (16و8) (شکل 2).
اين دومن يک ساختمان گوه اي شکل است که از دو روقة ? موازي و در خلاف جهت هم ساخته شده اند يک ورقة ? ديواره گوه را مي سازد و ورقه ديگر که در مرکز قرار دارد، هم ديواره و هم کف گوه را شکل مي دهد. گوه اي شکل بودن اين ساختمان باعث فشرده شدن واحدهاي ساختماني شده و ايجاد يک پوستة سخت و فشرده را تسهيل مي نمايد. فشردگي دومن هاي ?- barrel توسط شبکه اي از تداخلاي پروتئين- پروتئين در روي کپسيد داخلي بويژه در اطراف گوشه هاي 5 ضلعي تقويت مي گردد (8و16).
پروتئين هاي کپسيد از نظر سکانس متفاوت و از نظر توپولوژي يکسان هستند و مهمترين تفاوت پروتئين هاي VP1، VP2 ، VP3در لوبهاي صفحات بتا(?) و در قسمتهاي انتهاي آميني (N- Terminal ) و انتهاي کربوکسيلي (C- Terminal) مي باشد. انتهاي کربوکسيلي در سطح خارجي و انتهاي آميني در سطح داخل ويروس قرار دارد (16).
دومن هاي ?- barrelدقيقاً مشابه با ويروسهاي گياهي نظير Southem bean mosaicوTomato bushy stunt مي باشد. پروتئين هاي اين دسته از ويروسها هيچ گونه همولوژي توالي با پيکورناويروسها ندارند. فرضيه اي که مطرح است اين است که 1- پلي پپتيدها از يک جد مشترکي تکامل يافته اند. 2- دومن ?- barrelيکي از محدود راههايي است که به پروتئين ها اجازه مي دهد تا به فرم يک کره فشرده تجمع يابند (18 و 17).
(2-4-1 سطح خارجي ويريون:
سطح ويريون پيکورناويروس هاي که شياردار است و توسط يک شکاف عميق بنام کانيون ( Canyon ) احاطه مي گردد .
(3-4-1 کانيون(Canyon):
پروتئين هاي VP3- VP1 شيارهاي باريکي را تشکيل مي دهند که کا نيون گويند. کانيون يک ناحيه بسيار فشرده و باريک است که مانع نفوذ عمقي مولکول هاي آنتي بادي مي شود. در بعضي از پيکورنا ويروسها کانيون به عنوان محل اتصال به گيرنده عمل مي کند مثل راينووپوليوويروس سطح آفتوويروس و کارديو فاقد کا نيون است و ويريون آنها صاف تر از پيکورنا ويروس هاي ديگر است (20) (شکل3).
شکل 2- دياگرام شماتيک 8 زنجيره? که ساختار گره اي شکل را بوجود مي آورند.در اينجا لوپ هايي وجود دارد که رابطي بين ورقه هاي زنجيره? مي باشد.اين لوپ ها سطح ويريون را مي پوشاند و به هر زير واحد vp1-4 مورفولوژي و آنتي ژنيسيته ويژه اي مي بخشند. در اکثر پيکورنا ويروس ها محل هاي آنتي ژنيک خنثي نوتراليزان در لوپ هايBC از VP1و VP3 يا لوپ EF درVP2 واقع شده اند.
شکل 3- مدلي از پوليوويروس تيپ 1- تاج ستاره اي شکل و ناحيه کانيون در اطراف آن مشخص است.
(4-4-1سطح داخلي ويريون:
شبکه اي که توسط انتهاي آمين پروتئين هاي کپسيدي در سطح داخلي ويريون شکل مي گيرد و نقش آن در پايداري کپسيد و ويريون مي باشد. در تقارن چرخشي 5 انتهاي آميني از 5´ مولکول VP3 يک ورقه بتاي موازي و سيلندري شکل را بوجود مي آورند. اين ساختار توسط پنج ورقه بتاي سه زنجيره اي احاطه شده است. ارتباط بين اين دو ساختار از طريق گروه ميريستات ( Myristate) متصل شده به انتهاي آميني ازVP4برقرار مي گردد (4).
(5-4-1نقش پاکت هيدروفوبيک:
در کف کانيون ناحيه اي بنام پاکت ( pocket ) وجود دارد که در اين منطقه ليپيدهاي مختلف قرار دارند و اين پاکت در پوشش برداري ويروس نقش دارد و بعضي از داروهاي ضد ويروسي روي اين پاکت اثر و مانع از پوشش برداري ويروس مي گردند (20).
(6-4-1 نقش ميرستيک اسيد:
در اغلب ويروسهاي خانوادة پيکورنا ويروس، اسيد ميريستيک توسط پيوندهاي کووالانسي به اسيد آمينه گليسين در انتهاي آميني VP4 متصل مي شود (18). گروههاي مريستيل سبب واکنش اسيدهاي آمينه موجود در پروتئين VP3 و VP4شده و اين مريستيه شدن در تجمع (Assembley) و پايداري کپسيد نقش دارد(19 ).
شکل 4- تداخلات ميريستات با پروتئني هاي سطح ويروس.
1-5) ساختار ژنوم در پيکورنا ويروس ها:
ژنوم پيکورنا ويروسها بصورت RNA تک رشته با پلاريته مثبت ( +SSRNA) مي باشد. اين ژنوم عفونت زا بوده و پس از ترانسفکت نمودن سلول مي تواند به پروتئين هاي لازم براي تکثير ويروس ترجمه گردد. ساختار ژنوم شامل قسمتهاي زير مي باشد.(شکل5)
شکل 5- تصوير شماتيک ژنوم پيکورنا ويروسها: در ابتداي 5´ ژنوم پروتئين Vpgو بعد از آن ناحيه 5´- UTR (بخش5´ غير کد کننده) واقع شده است. در انتهاي 3´ هم توالي 3´-UTR و دنبالة PolyAقرار دارد در بين اين نواحي غير قابل ترجمه بخش کد کننده پروتئين هاي ساختماني P1 و غير ساختماني P2 / P3 واقع مي شود. اين توالي تنها در ژنوم کارديوويروسها و آفتوويروسها مشاهده شده است.
( Vpg ) viral protein genome linked (1-5-1 :
در ابتداي 5´ژنوم پيکورنا ويروسها، پروتئيني به نام Vpg قرار دارد (21). در ژنوم همة پيکورناها Vpg وجود دارد ولي طول آن از 22 تا 24 اسيد آمينه متفاوت است. Vpgبا پيوند کووالانسي به نيمه5´يوريديلات از RNA ي ويروسي توسط يک پيوند 5´-0-4´يوريدنيل- تيروزين متصل مي شود. معمولاً تيروزيني که به RNAويروس متصل مي شود، سومين اسيد آمينه از انتهاي آميني Vpo مي باشد در همة پيکورنا ويروسها Vpgتوسط يک ژن منفرد( 3B) کد مي گردد، در حاليکه در FMDV سه ژن مسئول کد کردن Vpgهستند اگر Vpgرا از ابتداي ژنوم حذف کنيم عفونت زايي اختصاصي ويروس کاهش نمي يابد. Vpgفقط در RNAديده مي شود و در mRNAديده نمي شود اين پروتئين توسط Un linking enzyme سلول هاي ميزبان از ژنوم برداشته مي شود (23و22). تنها تفاوت بين RNAژنومي و mRNA پوليوويروس ، عدم وجود Vpgدر MRNAمي باشد. Vpgدر زنجيرة RNA حد واسط و RNA زنجيره منفي وجود دارد و عنوان مي گردد که احتمالاً Vpg به عنوان پرايمر در سنتز RNAدخالت داشته باشد (24).
5´- UTR(2-5-1 :
6(5´- UTR) منطقه اي بلند و حاوي 624 تا 1199 نوکلئوتيد است که بعد از Vpg قرار دارد. اين ناحيه در روند تکثير و ترجمة ژنوم مؤثر است (25).
IRES(3-5-1 :
در 5´- UTR، ناحيه اي به نام 7IRES وجود دارد که حاوي 2400- 2100 نوکلئوتيد است. ريبوزوم براي ترجمه به اين قسمت چسبيده و سنتز پروتئين را شروع مي کند. دو تيپ اصلي از IRESوجود دارد. اين عناصر در جهت دهي عمل ترجمه دخالت مي کنند. در آفتوويروس ها و کارديوويروسها قسمت 5´- UTRواجد يک ناحية POLY (C)مي باشد که تعداد بازهاي آن ( 80 تا 250 نوکلئوتيد در کارديوويروسها و 100 تا 170 نوکلئوتيد در آفتوويروسها ) متفاوت است. برخي از محققين طول بيشتر قطعة POLY (C)در کارديو را مرتبط با ويرولانس بيشتر آنها در حيوانات مي دانند (25).
شکل6: دو تيپ اصلي از IRESدر پيکورنا ويروسها: تصوير سمت چپ بخش 5´- UTRپوليوويروس (تيپ I ناميده مي شود و در انتروويروس ها و رينوويروس ها نيز ديده مي شود) و تصويرسمت راست بخش 5´- UTRانسفالوميوکارديتيس ويروس تيپ II نام دارد و در آفتوويروسها و کارديوويروسها مشاهده مي شود) را نشان مي دهد. ناحية IRESدر داخل مستطيل مشخص مي باشد. IRESهپاتو ويروسها با اين دو شکل فرق دارند و برخي مقالات آنرا بعنوان تيپ سوم IRESمطرح مي کنند.
(ORF) open Reading Frame(4-5-1 :
بعد از ناحية 5´- UTR، ناحية ORF قرار دارد که بعد از آلودگي توسط ويروس ORFبه يک پلي پروتئين بزرگ ترجمه شده و سپس توسط پروتئازهاي ويروسي به 11 تا 12 پروتئين شکسته مي شود و عملکرد آن جهت تهيه پروتئين هاي ساختماني و غير ساختماني ويروس مورد استفاده قرار مي گيرد.
3´- UTR(5-5-1:
در پيکورنار ويروس ها 3´- UTRکوتاه تر از 5´- UTR مي باشد. اين ناحيه در رينويروسها 47 نوکلئوتيد و در EMCV بين 14 تا 125 نوکلئوتيد طول دارد. در ناحية 3´- UTR8يک ساختار ثانويه بنام pseudo knot وجود دارد که سنتز RNA ويروس را کنترل مي نمايد (26 و 27).
Poly (A) (6-5-1 :
به انتهاي 3´ژنوم يک قطعه Poly (A)اتصال مي يابد که طول متوسط آن از 35 نوکلئوتيد درEMCVتا 100 نوکلئوتيد در FMDV متغير است و اگر دنبالة Poly (A)حذف گردد عفونت زايي ويروس از بين مي رود.
در پيکورنا ويروس ها، بخش کد کننده پروتئين هاي ساختماني9 و غير ساختماني10 را به صورت p3, p2, p1مشخص مي کنند. آفتو ويروس و کارديوويروسها يک پروتئين رهبر11 (L) را قبل از قسمت P1کد مي کنند. قسمت P1 ,پروتئين هاي ساختماني را کد مي کند ولي P2 و P3 پروتئين هاي غير ساختماني را کد مي کنند. پروتئين هاي غير ساختماني در پردازش پروتئين هاي ديگر (2A pro,3c pro, 3cd pro )و تکثير ( 2B, 2C, 3AB, 3B vpg, 3D pol ) مشارکت دارند (1).
1-6) سيکل تکثير پيکورنا ويروسها:
تکثير به طور کامل به مدت 10-6 ساعت در سيتوپلاسم سلول آلوده به ويروس صورت مي گيرد.
مراحل تکثير به صورت خلاصه و به ترتيب عبارتند از:
1-اتصال به رسپتور Attachment
2- ورود و پوشش برداري Enterance and uncoating
3- ترجمه ژنوم Translation and synthesis
4- پردازش پلي پروتئين Polyprotein processing
5- توليد ذرات جديد ويروسPyogen viruses
شکل 7- چرخة تکثير پيکورناويروس : 1- اتصال به گيرنده 2- مرحلة پوشش برداري 3- Vpg از ابتداي ژنوم حذف و سپس RNA ترجمه مي گردد 4- پلي پروتئين حاصل از ترجمه توسط پروتئازهاي ويروسي به پلي پپتيد مجزا کليواژ مي گردد. 5- سنتز RNA بر روي غشاء وزيکول روي مي دهد. ژنوم ويروس توسط RNAپليمراز به RNAکامل زنجير منفي (آنتي ژنوم) تبديل مي شود. 6- از روي آنتي ژنوم تعداد زيادي RNAزنجيره مثبت ساخته مي شود. 7- اين زنجيره هاي مثبت در ابتداي سيکل عفونت به پروتئين هاي مورد نياز جهت تکثير ويروس تبديل مي شوند و در اواخر سيکل عفوني به عنوان پروژنوم جهت توليد ويروس مورد استفاده قرار مي گيرند. 8و9- مراحل اسمبلي و خروج ويروسها از سلول آلوده.
1-61-)اتصال Attacment :
پيکورنا ويروسها براي عفونت زايي نيازمند اتصال به غشاء سلول ميزبان مي باشد تا از اين طريق داخل سلول ميزبان گردد. اين عمل توسط يک سري مولکولهاي سطحي غشاء انجام مي شود، اين مولکولها از سال 1989 با شناخت رسپتورهاي سطحي بر عليه پوليوويروس و رينوويروس تشخيص داده شدند (28).
در زمينه رسپتورهاي پيکورنا ويروس ها سه نکته مهم مشخص گرديده است:
الف) پيکورنا ويروس ها از رسپتورهاي متفاوتي براي ورود به سلول استفاده مي کنند.
ب) قسمتي از رسپتورها درون سلول قرار دارند مانند رسپتور کوکساکي ويروس B و A و انتروويروس .
ج) در بعضي از پيکورنا ويروس ها وجود يک رسپتور براي عفونت زايي ويروس کافي است ولي در بعضي ديگر نياز به دو يا چند رسپتور است براي مثال، در کوکساکي ويروس A21 که رسپتور آن CD55 است براي ورود به درون سلول نياز به 12ICAM-1 دارند (29). بعضي از کوکسا کي ويروس هاي گروه B علاوه بر رسپتور CD55 از ? V ?6 Integrinنيز به عنوان کورسپتور جهت اتصال به سلول استفاده مي کنند (4). بر اساس اينکه ويروس از کجا منشاء مي گيرد ويروسهاي مشخص به رسپتورهاي سطحي متفاوتي متصل مي شوند به طور مثال FMDV – A12 به اينتگرين ? V?3اتصال مي يابد. ولي استرين O- FMDVکه به مدت طولاني در کشت سلولي رشد کرده است نمي تواند به اين رسپتور متصل شود و بجايش هپاران سولفات به سطح سلول متصل مي شود. استرين FMDV – A12نمي تواند سلولهاي راکه فاقد ?6 Integrin ? هستند را آلوده کند حتي اگر هپارين سولفات در سطح سلول باشد. اين موضوع نشان مي دهد که ويروس خود را در آزمايشگاه سازگار نکرده است و در نبود رسپتور اصلي, خود بتدريج قادر به استفاده از رسپتورهاي ديگر شده است (9).
(جدول 2) گيرنده ها و کمک گيرنده هاي مورد استفاده در پيکورنا ويروس.
1-62-) مکانيسم اتصال به گيرنده هاي سطح سلولي:


پاسخ دهید