2-12-1- علل ايجاد چندشکلي حاصل از نشانگر مولکولي ISSR25
2-12-1-1- نمونه DNA25
2-12-1-2- ماهيت آغازگر25
2-12-1-3- روش مورد استفاده براي تشخيص باندها26
2-12-2- مزاياي نشانگرهاي ISSR26
2-12-2-1- تکرارپذيري بسيار بالا26
2-12-2-2- دقت بالا27
2-12-2-3- تنوع بالا27
2-12-2-4- هزينه پايين27
2-12-2-5- سرعت و سهولت اجرا27
2-12-3- معايب نشانگرهاي ISSR27
2-12- 4- انواع نشانگرهاي ISSR28
2-12-4-1-تکنيک MP-PCR 28
2-12-4-2- تکنيک F-ISSR28
2-12-5-کاربرد نشانگرهاي مولکولي ISSR29
2-12-5-1- انگشتنگاري ژنومي 29
2-12-5-2- مطالعات تنوع ژنتيکي و تجزيه و تحليل فيلوژنتيکي29
2-12-5-3- نقشهيابي ژنتيکي30
2-12-5-4- نشانمند کردن ژن و انتخاب به کمک نشانگر30
2-12-5-5- مشخص کردن فراواني تواليهاي ريزماهوارهاي 30
2-12-5-6- کاربرد نشانگرهاي ISSR در شناسايي و ردهبندي گونهها31
2-13- تجزيه و تحليل تنوع ژنتيکي31
2-14- تخمين فاصله ژنتيکي32
2-14- 1- روش گروهبندي افراد يا جمعيت ها32
2-14-1-1-تجزيه خوشه اي33
2-14-1-2- تجزيه به مختصات اصلي (PCoA)34

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

2-14-2- معيارهاي سودمندي نشانگرها34
2-14-2-1- محتوي اطلاعات چندشکلي34
2-14-2-2- احتمال همساني35
2-14-2-3- قدرت تفکيک35
2-15- مروري بر مطالعات ژنتيکي و مورفولوژي انجام شده روي گونه هاي آژيلوپس35
فصل سوم (مواد و روشها)40
3 -1- مواد گياهي41
3-2- آغازگرها43
3-3- مکان و زمان انجام آزمايش مولکولي43
3-4- عمليات زراعي44
3 -4-1- مشخصات جغرافيايي محل انجام آزمايش مزرعه‌اي44
3 -4- 2- طرح آزمايشي و مراحل اجراي آن44
3 -5- استخراج DNA ژنومي45
3-6- تعيين کميت نمونه هاي DNA ژنومي47
3 -7- تعيين کيفيت نمونه هاي DNA ژنومي48
3 -8- روش تهيه آگاروز 8/0و 5/1 درصد براي تعيين کميت وکيفيت و تفکيک قطعات تکثير شده48
3-9- آماده سازي نمونه ها واجراي الکتروفورز ژل آگاروز49
3-10- اجزاي واکنش زنجيره اي پليمراز50
3-11- سيکل حرارتي و مراحل واکنش زنجيرهاي پليمراز50
3 -12-توان و زمان مورد نياز براي الکتروفورز محصول PCR51
3 -13- مواد تشکيل دهنده بافرTE52
3-14- تهيه بافر TAE10X52
3 -15- اتيديوم برومايد53
3 -16- رنگ بارگذاري53
3 -17- مراحل رنگ آميزي تا ظاهرسازي قطعات تکثير شده53
3-18- تجزيه وتحليل داده ها54
3-18-1- امتيازبندي باندهاي حاصل از داده هاي مولکولي54

3-18-2- تجزيه خوشه اي و آناليز مولکولي………………………………………………….54
فصل چهارم(بحث و نتيجهگيري)……………………………………………………………..55
4-1- نتايج استخراج DNA ژنومي56
4 -2- نتايج واکنش زنجيرهاي پليمراز56
4 -3- محاسبه چندشکلي نشانگرهاي ISSR58
4-4- محاسبه محتواي اطلاعات چندشکلي نشانگرهاي ISSR59
4-5- محاسبه شاخص نشانگر(MI) نشانگرهاي ISSR……………………………………60
4 -5- محاسبه ضرايب همبستگي کوفنتيک61
4-6- ترسيم دندروگرام جمعيتهاي Ae.crassa62
4-7- تجزيه به مختصات اصلي با استفاده از نرمافزار DARWin وترسيم نمودار سه بعدي جمعيتها با نرمافزار Minitab63
4-8- محاسبه فاصله ژنتيکي درون و بين جمعيتهاي Ae.crassa64
4-9- محاسبه ماتريس فاصله و تشابه ژنتيکي شاخص Nei ……………………………66
4 -10- ميزان آللهاي چندشکل در جمعيتهاي Ae.crassa69
4-11- محاسبه شاخصهاي ژنتيکي در جمعيتهاي Ae.crassa70
4 -12- تجزيه واريانس مولکولي71
4-13- بررسي صفات مورفولوژي72
4-13-1- همبستگي ساده فنوتيپي72
4-13-2- تجزيه کلاستر (خوشهاي)…………………………………………………………..74
4-13-3- تجزيه به مولفه هاي اصلي76
4 -13-4- تجزيه عليت (مسير)78
4-14- نتيجهگيري کلي مولکولي80
4-15- نتيجهگيري کلي مورفولوژيکي……………………………………………………….81
4-15-1 پيشنهادات83
منابع…………………………………………………………………..84
فهرست جدولها
جدول 3-1- نمونههاي آژيلوپس کراسا استفاده شده در اين تحقيق…………………………..44
جدول 3-2-آغازگرهاي ISSR استفاده شده در اين تحقيق42
جدول 3-3- خصوصيات فيزيکي و شيميايي خاک محل اجراي آزمايش43
جدول 3-4 اجزاء تشکيل دهنده بافر استخراج ………………………………………….DNA46
جدول3-5- اجزاي مورد استفاده براي انجام واکنش PCR50
جدول 3-6- چرخه حرارتي مورد استفاده جهت انجام واکنش PCR51
جدول 3-7- مواد لازم جهت تهيه يک ليتر بافر TE52
جدول 3-8- مواد لازم جهت تهيه يک ليتر بافر X10TAE52
جدول 3-9- مراحل رنگآميزي تا ظاهرسازي قطعات تکثير شده53
جدول 4-1- درصد چندشکلي محاسبه شده برايهرآغازگردرتحقيق حاضر59
جدول4-2- محتواي اطلاعات چندشکلي محاسبه شده براي هر آغازگر60
جدول 4-3- ضرايب کوفنتيک حاصل از روشهاي مختلف براي نشانگر ISSR …………..61 جدول 4-4- فاصله ژنتيکي درون و بين جمعيتهاي Ae.crassa…………………………….. 65 جدول4-5 – ماتريس فاصله ژنتيکي Nei بين جفت جمعيتهاي Ae.crassa براساس نشانگر ISSR ……………………………………………………………………………………….. 67 جدول4-6- ماتريس تشابه ژنتيکي Nei بين جفت جمعيتهاي Ae.crassa براساس نشانگر ISSR. ………………………………………………………………………. 68
جدول 4-7-ميزان آللهاي چندشکل در جمعيّتهاي Ae.crassa…………………………….69 جدول 4-8- محاسبه شاخص هاي ژنتيکي درجمعيت آجيلوپس کراسا با استفاده از نرمافزا ر GenAlEx ……………………………………………………………….. 70
عنوان و شماره صفحه جدول 4-9- تجزيه واريانس مولکولي جمعيت Ae.crassa71
جدول 4-1- ضرايب همبستگي بين صفات ارزيابي شده Ae.crassa73
جدول4-11- سطوح تشابه و فاصله روي 16 جمعيت Ae.crassa با استفاده از تجزيه کلاسترسلسله مراتبي(آشيانهاي)74
جدول4-12- بردارهاي مشخصه براي متغيرهاي ارزيابي شده با استفاده از تجزيه به مؤلفههاي اصلي………………………………………………………………………………………………………77
جدول 4-13- تجزيه ضرايب عليت اثرات مستقيم و غيرمستقيم متغيرهاي ارزيابي شده روي عملکرد دانه…………………………………………………………………………………………..79
فهرست شکلها
عنوان و شماره
شکل2-1- تصوير شماتيک از ISSR-PCR24
شکل3-1- نمايي از مزرعه آزمايشي………………………………………………………….45
شکل 4-1- نتايج استخراج DNA ژنومي 16 جمعيت Ae.crassa…………………………… 56 شکل 4-2- آللهاي حاصل از تکثير DNA جمعيتهاي مختلف توسط آغازگرISSR……. 56 شکل 4-3- دندروگرام حاصل از 105 آلل تکثير شده در 16 جمعيت Ae.crassa با استفاده از ماتريس حاصل از شاخص Nei با الگوريتم اتصال مجاور…………………………………. . 63 شکل4-4- نمودار سهبعدي حاصل از تجزيه به مختصات اصلي 16 جمعيت Ae.crassa با استفاده از داده‌هاي حاصل از نشانگر ISSR ، بر روي سه مختصات اول،دوم وسوم………………… 64 شکل 4-5- ميزان درصد تغييرات درون و بين جمعيتهاي Ae.crassa…………………… 72 شکل4-6- دندروگرام حاصل از تجزيه کلاستر متغيرهاي ارزيابي شده روي جمعيت Ae.crassa …………………………………………………………………….. 75 شکل 4-7- اسکري پلات براي متغيرهاي ارزيابي شده در Ae.crassa………………………. 76
1-1- مقدمه
ايران يکي از غني ترين مراکز دنيا از نظر ذخاير ژنتيکي گياهي محسوب مي‌شود. به عقيده گياهشناسان ايراني حدود 10 الي 12 هزار گونه گياهي در ايران وجود دارد که آن را به عنوان يکي از غني ترين مراکز تنوع ذخاير توارثي گياهي در جهان ساخته است.گونه هاي وحشي به لحاظ داشتن ژن هاي مفيد براي مقاومت به تنش هاي زنده و غيرزنده و گسترش سازگاري ژنتيکي در برابر تغييرات محيطي داراي اهميت مي‌باشند. براي استفاده از اين منابع، اطلاع از ماهيت و ميزان تنوع موجود در ژرم‌پلاسم، از اهميت ويژه‌اي برخوردار است [108] . بررسي تنوع ژنتيکي در گياهان زراعي براي برنامه هاي اصلاحي و حفاظت از ذخاير توارثي، حياتي بوده و اطلاع از سطح تنوع ژنتيکي در گونه گياهي براي انتخاب والدين جهت رسيدن به هيبريد مناسب از اهميت زيادي برخوردار است [109]. بررسي تنوع ژنتيکي همچنين از جنبه مديريت موثر و حفظ منابع ژرم پلاسم داراي اهميت مي‌باشد [96]. روش‌هايي که براي تخمين تنوع ژنتيکي مورد استفاده قرار گرفته‌اند متفاوت مي‌باشند. از جمله‌ي آن‌ها مي توان ثبت شجره، خصوصيات مورفولوژيکي و نشانگرهاي مولکولي را نام برد [41]. آگاهي از تنوع ژنتيکي ژرم‌پلاسم ها معياري مناسب براي استفاده از آن‌ها در شناسايي و انتقال ژن‌ها در بهبود گياهان زراعي مي‌باشند [41]. تنوع ژنتيکي اساس بيشتر برنامه‌هاي اصلاحي بوده و انجام گزينش منوط به وجود تنوع ژنتيكي مطلوب از نظر ويژگيهاي مورد بررسي مي‌باشد [32]. مطالعه تنوع ژنتيكي فرآيندي است كه تفاوت يا شباهت گونه‌ها، جمعيت‌ها و يا افراد را با استفاده از روش‌ها و مدل‌هاي آماري خاص بر اساس صفات مورفولوژيك، اطلاعات شجره‌اي يا خصوصيات مولكولي افراد بيان مي‌کنند [32]. تعيين سطح تنوع ژنتيکي يکي از مراحل اساسي در مديريت مؤثر و استفاده از ذخاير ژنتيکي مي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد [96،23،7]. منابع ژنتيكي يا ذخاير توارثي به دليل اهميت فراواني كه دارند يكي از ارزشمند ترين ثروت هاي ملي و منابع پايه اي در هر كشور محسوب مي‌شوند [1]. يکي از عواقب اصلاح‌نباتات موفق، افزايش فرسايش يا کاهش منابع ژنتيکي گياهي بوده که تحت برنامه انتخاب قرار گرفته‌اند. در سال هاي اخير عوامل بسيار زيادي در فرسايش ژنتيکي و نابودي ذخاير ژرم‌پلاسم نقش داشته‌اند [16]. استفاده از واريته‌هاي اصلاح شده بجاي واريته‌هاي بومي، اعمال روش‌هاي مدرن زراعي مانند استفاده از سموم علف‌کش، پيشرفت شهرها و مراکز صنعتي، مسکوني شدن زمين هاي زراعي و مرتعي، تغيير روش هاي کشت و ساير عواملي که منجر به فرسايش و انقراض مواد با ارزش مي‌شوند که به‌طور مستقيم وغير مستقيم در کشاورزي و اصلاح نباتات قابل استفاده هستند. بنابراين حفاظت و استفاده از منابع ژنتيکي گياهي براي بقا و بهبود توليدات زراعي ضروري بوده و به عنوان نيازي اساسي در توسعه پايدار و کاهش فقر محسوب مي‌شود. تنوع ژنتيکي اساس اکثر برنامه هاي اصلاح نباتات مي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد [111،74،7]. موفقيت در اصلاح يک گياه زراعي، در درجه اول به دسترسي تنوع ژنتيکي موجود در آن گياه بستگي دارد، ضمن اينکه تنوع ژنتيکي يکي از ارکان اصلي کشاورزي پايدار است و وجود تنوع ژنتيکي در نظام‌هاي زراعي با درس گرفتن از طبيعت بايد همواره مد نظر قرار گيرد. مديريت و استفاده صحيح از تنوع موجود در ارقام محلي و خويشاوندان وحشي يک گونه گياهي در اجراي برنامه‌هاي موثر اصلاحي بسيار مهم است. اولين قدم در اصلاح يک گياه، شناسائي دقيق ساختار ژرم‌پلاسم آن گياه است که اين مطلب خود نمونه‌گيري منظم و دقيق از ژرم‌پلاسم را براي اهداف اصلاحي و حفاظتي امکان پذير خواهد ساخت. کاهش تنوع علاوه بر کاهش بازده برنامه هاي اصلاحي، باعث يکنواختي ژنتيکي در مزارع و آسيب‌پذيري شديد محصولات کشاورزي در برابر آفات، بيماري‌ها و تنش‌هاي محيطي مي‌گردد. خويشاوندان وحشي گياهان، دربردارنده منابع ژني با ارزش براي مقاومت به تنش‌هاي زنده و غيرزنده مي باشند.
توده‌هاي وحشي و نژادهاي بومي از مهم‌ترين منابع تنوع ژنتيکي در دسترس مي‌باشند [26]. اهلي‌سازي جمعيت‌هاي برتر انتخاب شده از بين تعداد زيادي توده مي‌تواند پيشرفت قابل توجهي در تأمين نياز صنايع وابسته بدون نياز به روش‌هاي پرهزينه و گران اصلاحي ايجاد نمايد [26]. اهلي‌کردن، فرآيندي طولاني است، اما با انتخاب مناسب در شروع به شدت بر سرعت آن افزوده مي‌شود [26]. بنابراين، با بررسي تنوع موجود، آگاهي از ساختار ژنتيکي جمعيت و بررسي تنوع فنوتيپي و ويژگي‌هاي شيميايي مي‌توان در بين توده‌هاي طبيعي به انتخاب، به‌عنوان اولين روش اصلاحي در طي اهلي‌کردن پرداخت [26]. تنوع ژنتيکي، کليدي براي به‌نژادي گياهان است. دانش روابط ژنتيکي بين توده‌هاي مختلف به مديريت ژرم‌پلاسم کارآمد و استراتژي‌هاي بهره‌برداري کمک بزرگي مي‌نمايد. تنوع ژنتيکي گياهان طي هزاران سال ايجاد شده و در طبيعت به صورت پايدار باقي مانده است [26].
ارقام بومي گياهان زراعي و خويشاوندان وحشي آن‌ها، به دليل قدمت و سازگاري‌شان به شرايط زيستي و عوامل نامسائد محيطي داراي مناسب‌ترين ژن‌ها بوده وتنوع ژنتيکي مورد نياز اصلاح گياه را تأمين مي‌نمايد [13]. تعيين ميزان تنوع ژنتيکي در مواد گياهي گام اوليه براي شناسايي، حفظ ونگهداري ذخايرتوارثي ونيز پايه اساسي و اوليه براي تحقيقات ژنتيکي و برنامه‌هاي اصلاحي مي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد [27].
گياه Aegilops crassa،داراي دو سيتوتيپ تتراپلوئيد وهگزاپلوئيد با ژنوم ( 2n=2x=28 McrMcrDcr1Dcr1) و (2n=6x=42 McrMcrDcr1Dcr1 Dcr2Dcr2 ) است [44]. تجزيه جفت شدن کروموزوم‌هاي ميوزي در هيبريدهاي بين سيتوتيپ‌هاي تتراپلوئيد وهگزاپلوئيد Ae. crassa بيانگر آن است که فرم هگزاپلوئيد از هيبريداسيبون بين فرم تتراپلوئيد Ae. crassa و Ae. tauschii حاصل گرديده است. اما در حال حاضر منشأ سيتوتيپ تتراپلوئيد Ae. crassa را نمي‌توان با دقت تعيين کرد [69]. گياهي يکساله و متعلق به خانواده گرامينه1 يا پواسه2 و طايفه تريتيسه3 مي‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد، اين گونه به عنوان يک علف هرز شايع در مزارع گندم نان ديده مي‌شود [57،56]. آژيلوپس کراسا در ترکيه، فلسطين، سوريه، اردن، ايران، عراق، لبنان، افغانستان، ترکمنستان و پامير و کوه‌هاي آلتاي پراکنده است، در ايران داراي دامنه پراکنش بسيار وسيعي بوده و از دامنه‌هاي البرز در شرق کشورتا شمال غرب در آذربايجان غربي وبر روي دامنه‌هاي رشته‌کوه زاگرس تا سواحل جنوبي در ارتفاعات استان بوشهر وهرمزگان مي‌رويد [101،40]. اين گونه به عنوان يک منبع صفات مفيد از قبيل تحمل به شوري، مقاومت به آفت و تحمل به سرما شناخته شده است [87،4]. مطالعه‌ي گونه‌هاي آژيلوپس در نقاط مختلف دنيا نشان مي‌دهد که اين گونه‌ها منابع ژنتيکي بي‌نظيري براي اصلاح گندم مي‌باشند [33،17].
توده‌هاي بومي يک گياه، ژرم‌پلاسم مناسبي براي برنامه‌هاي اصلاحي محسوب مي‌شوند. بررسي تنوع ژنتيکي در گياهان از طريق بررسي صفات مورفولوژيکي و بيوشيميايي همواره متداول بوده است. باتوجه به اينکه اندازه‌گيري صفات مورفولوژيکي نياز به صرف وقت، انرژي و هزينه زيادي دارد و به دليل تاثير عوامل محيطي بر بيان ژن و بروز صفات، بررسي تنوع ژنتيکي از طريق بررسي ويژگي‌هاي مورفولوژيکي روش قابل اعتمادي براي تعيين تفاوت‌هاي ژنتيکي نيست [8]. براي بررسي تنوع ژنتيکي مي‌توان از نشانگرهاي مورفولوژيکي، پروتئيني و نشانگرهاي مولکولي استفاده نمود [113،102]. بررسي تنوع ژنتيکي در گياهان، از طريق صفات مورفولوژيکي متداول بوده است [3]. با اين وجود نشانگرهاي مورفولوژيکي داراي معايب زيادي مي‌باشند. از جمله اين که تحت تأثير شرايط محيطي و مرحله‌ي رشد موجود قرار مي‌گيرند و پايداري کمي دارند [29]. بنابراين استفاده از نشانگرهاي مولکولي يکي از ابزارهاي بسيار مهم و قوي در زمينه بررسي تنوع ژنتيکي و انگشت نگاريDNA مي‌باشدکه در ارزيابي روابط خويشاوندي ژنتيکي، انتخاب گياهان برتر و بررسي شباهت يا تفاوت بين نمونه‌هاي مختلف کاربرد دارند [27]. همچنين استفاده از اين نشانگرها در مديريت ژرم‌پلاسم و انتخاب براساس نشانگر4 (MAS)، براي افزايش کارايي اصلاح و تکثير ژرم‌پلاسم مفيد مي‌باشد [27]. انتخاب نوع نشانگرهاي مولکولي به تکرارپذيري و سادگي روش کار آن بستگي دارد. بهترين نشانگري است که داراي هزينه اجراي پايين و قابليت اعتماد بالايي باشد. نشانگرهاي مولکولي به دو دسته نشانگرهاي بيوشيميايي و نشانگرهاي مبتني بر DNA تقسيم مي‌شوند. [3]. نشانگرهاي مبتني بر DNA نسبت به نشانگرهاي مورفولوژيکي و پروتئيني، کاربردي تر و داراي مزاياي بيشتري مي‌باشند. بررسي DNA گياهي امکان ارزيابي مستقيم تنوع ژنتيکي را ممکن مي‌سازد [3]. تاکنون تعداد زيادي از نشانگر‌هاي مبتني بر DNA معرفي شده‌اند و در تجزيه‌هاي ژنتيک موجودات مورد استفاده قرار گرفته‌اند نشانگرهاي مبتني بر DNA نسبت به نشانگرهاي مورفولوژيکي و پروتئيني، کاربردي تر و داراي مزاياي بيشتري مي‌باشند [28]. اين نشانگر ها از نظر بسياري از ويژگي‌ها از قبيل درجه چندشکلي5، غالب6 يا هم بارز7 بودن، تعداد جايگاه‌هاي تجزيه‌شده در هر آزمايش، توزيع در سطح کروموزوم، تکرارپذيري، نياز يا عدم نياز به توالي‌يابي DNA الگو و هزينه مورد نياز با همديگر متفاوت‌اند [28]. نشانگرهايي که چند شکلي را در سطح DNA آشکار مي‌نمايند، به عنوان يک ابزار قدرتمند براي توصيف و تنوع ژنتيکي شناخته شده‌اند [45]. نشانگرها با توجه به استراتژي پايه گروه‌بندي شده‌اند که مهمترين آن‌ها عبارتند از: روش‌هاي غير مبتني بر PCR (RFLP و …) و تکنيک‌هاي مبتني بر PCR (RAPD، AFLP و ISSR و …).
نشانگرهاي مبتني بر DNA، براي اصلاح گياهان زراعي روند رو به رشدي داشته اند [84]. نشانگرهاي مبتني بر PCR از جمله RAPD ، AFLPو ريزماهواره ها8 ابزاري قدرتمند براي مطالعه تنوع ژنتيکي گندم‌هاي زراعي و وحشي محسوب مي‌شوند [110]. ريزماهواره‌ها نشانگرهاي مبتني بر PCR هستند که به خاطر سطوح بالاي چندشکلي، چنداللي‌بودن،وراثت هم‌بارز، پوشش وسيع ژنوم و سهولت در آشکارسازي مي توان از آن‌ها براي بررسي تنوع بين گونه هاي وحشي و زراعي استفاده کرد [95]. سيستم نشانگري SSR نياز به اطلاعات اوليه از توالي مورد هدف دو طرف نواحي تکراري، جهت طراحي آغازگر9 دارد، لذا سيستم نشانگري 10ISSRمي‌تواند بر اين محدوديت‌ها غلبه کند و ميزان چندشکلي بيشتر و آشکارسازي راحت‌تري نسبت به نشانگرهاي مولکولي ديگر داشته باشد [19]. نشانگر ISSR نشانگري تصادفي است که در سال 1994 جهت تحليل ژنومي استفاده شده است. در اين نشانگر نواحي ريز‌ماهواره‌اي يکسان که در دو جهت مخالف و در فاصله‌اي قابل تکثير با آنزيم پلي مراز قرار گرفته باشند، تکثير مي‌گردند. دراين روش واکنش زنجيره‌اي پلي‌مراز باعث تکثير نواحي بين ريزماهواره‌ها در اندازه‌هاي متفاوت مي‌شود [119،96]. نشانگر ISSR داراي توانايي زيادي در بررسي روابط خويشاوندي و تکاملي گياهان و داراي چندشکلي قابل قبولي مي‌باشد. اين نشانگر تصادفي بوده و تکرارپذيري و چندشکلي بالايي دارد و در دامنه وسيعي از گياهان کاربرد دارد. آغازگرهاي مورد استفاده در اين نشانگر مکمل توالي‌هاي ريزماهواره‌اي هستند.
نشانگر ISSR براي مطالعات تنوع ژنتيکي، رده‌بندي، نشانمندکردن ژن‌ها، نقشه‌يابي ژنتيکي11 و زيست‌شناسي تکاملي به کار مي‌رود [96]. در بين نشانگرهاي مولکولي نشانگرهاي ISSR به طور گسترده‌اي در نواحي بين ريزماهواره‌اي در سرتاسر ژنوم پراکنده مي‌شوند. اين روش کاربردهاي جالبي در ژنتيک گياهي به‌خصوص در بررسي تنوع و ژنتيک جمعيت در گونه‌هاي گياهي که اطلاعاتي در مورد توالي آن‌ها در دسترس نيست، دارد [42،20]. اگرچه بسياري از توده‌هاي گندم در ايران جمع‌آوري شده‌اند، اما ژنتيک گندم وحشي و آژيلوپس در ايران هنوز تا حدود زيادي ناشناخته است [47]. بنابراين در تحقيق حاضر، سعي بر اين است که با بررسي تنوع ژنتيکي 16 جمعيت از گونهAe.crassa با استفاده از نشانگرهاي ISSR، گامي در جهت افزايش فهم ساختار ژرم‌پلاسم اين گونه برداشته شود.
1-2- اهداف تحقيق
به طور کلي اهداف اصلي اين تحقيق عبارت بودند از:
1. شناخت ارتباط ژنتيکي بين و درون توده هاي Ae.crassa ، گروه بندي آن‌ها و تشکيل يک درخت‌واره براساس انگشت‌نگاري12 ژنومي حاصل از نشانگرهاي ISSR
2. بررسي صفات ريختي و عملکرد و اجزاي عملکرد علوفه و دانه
3. مطالعه ميزان تنوع و تفرق ژنتيکي جمعيت‌هاي شناسايي شده به منظور مديريت بهتر ژرم‌پلاسم موجود و استفاده بهينه از آن در برنامه هاي به‌نژادي
4. استفاده از اطلاعات بدست آمده در برنامه‌ريزي حفاظت ژرم‌پلاسم و ايجاد کلکسيون از جمعيت هاي Ae.crassa
2-1- اهميت منابع ژنتيکي
منابع ژنتيكي يا ذخاير توارثي گياهي و جانوري به دليل اهميت فراواني كه دارند يكي از ارزشمند‌ترين ثروت‌هاي ملي و منابع پايه‌اي در هر كشور محسوب مي‎‌شوند [1]. ژنتيك گياهي به عنوان بخش مشخصي از تنوع زيستي13 در‌بردارنده مواد ژنتيكي است كه در اشكال اوليه و گونه‌هاي وحشي، واريته‌هاي بومي و سنتي و كولتوارهاي جديد وجود دارد. منابع ژنتيك گياهي منابعي را براي معيشت انسان اعم از تهيه غذا، چراي دام، تهيه سوخت‌، تهيه الياف، تهيه جان پناه، تهيه دارو و بسياري از مايحتاج ديگر انسان فراهم مي‌كند [35].
2-2- طبقه بندي منابع ژنتيکي گياهي
2-2-1- گونه‌هاي وحشي
توجه اندکي به حفظ گونه‌هاي وحشي معطوف شده و متأسفانه بسياري از گونه‌هاي قديمي به دليل کاربرد وسيع علف‌کش‌ها، ايجاد زمين‌هاي کشاورزي جديد و استفاده از ارقام يکنواخت از بين رفته‌اند و بدين ترتيب منابع ژنتيکي که مي‌توانند در حال و آينده در ايجاد و بهبود واريته‌هاي زراعي نقش داشته باشند را از دست داده‌ايم [53،19]. براي بسياري از گياهان زراعي، ژرم‌پلاسم وسيعي در گونه‌هاي وحشي وجود دارد و اين گونه‌ها محدوده وسيعي از تنوع ژنتيکي14 را نشان مي‌دهند اما به دلايل زير اين منابع ژني کمتر مورد استفاده قرار مي‌گيرند:
1-تلاقي گونه‌هاي وحشي با گونه‌هاي زراعي به سختي صورت مي‌گيرد و اغلب نتايج بدست آمده عقيم هستند.
2-سطوح پلوئيدي متفاوتي در گونه‌هاي وحشي وجود دارد و ناسازگاري بالائي را نشان مي‌دهند.
3-اطلاعات کمي از تاکسونومي گونه‌هاي وحشي در دسترس است.
با توجه به موارد ذکر شده، انتقال ژن از ژرم‌پلاسم گونه‌هاي وحشي به گونه‌هاي زراعي مشکل و اغلب ناموفق است [58]. هر چند امروزه با استفاده از روش‌هاي مهندسي ژنتيک اين مشکل تا اندازه‌اي مرتفع شده است. عليرغم مشکلات مطرح شده، مي‌توان از ژن‌هاي موجود در ژرم‌پلاسم گونه‌هاي وحشي به منظور افزايش مقاومت به آفات، بيماري‌ها و تنش‌هاي غير زنده و همچنين افزايش کميت و کيفيت محصول استفاده نمود. به‌طوري که 80 درصد از صفات مفيدي که از گونه‌هاي وحشي به گياهان زراعي منتقل شده، مربوط به مقاومت به تنش‌هاي زنده و غير زنده است [53].
2-2-2- گونه هاي زراعي
به ارقام اوليه‌اي که طي ساليان متمادي تکامل يافته و تحت تأثير انتخاب طبيعي به شرايط محيطي منطقه سازش يافته‌اند، توده بومي يا محلي مي‌گويند. تنوع بالائي درون اين جوامع موجب انعطاف‌پذير بودن و سازگار شدن آنها به شرايط نامساعد محيطي گرديده است [64،59]. ولي عملکرد پائين توده‌هاي بومي در مقام مقايسه با ارقام اصلاح شده موجب جايگزيني آنها توسط ارقام اصلاح شده گرديده است. اين موضوع که ارقام بومي از پايداري عملکرد بهتري برخوردار مي‌باشند و در شرايط نامساعد محيطي آسيب‌پذيري کمتري نسبت به ارقام جديد دارند، قابل توجه است. در حال حاضر بارزترين ارزش توده‌هاي بومي به لحاظ ژن‌هاي مفيد از جمله ژن‌هاي مقاومت به بيماري‌ها و آفات، کيفيت مواد غذائي و سازگاري به شرايط نامساعد طبيعي است که تاکنون ناشناخته مانده‌اند و در آينده مي‌توانند بسيار ارزشمند باشند، مربوط مي‌شود [19]. در حال حاضر مطالعات فراواني بر روي ارزيابي ژرم‌پلاسم بومي و گونه‌هاي وحشي گياهان زراعي مختلف در کشور صورت گرفته و در حال انجام است با اين وجود با توجه به فراواني تعداد اين منابع ژني، توجه بيشتر به اين موضوع را مي‌طلبد. ارقام بومي به سرعت در حال نابودي بوده و بدين ترتيب جمع‌آوري و نگهداري آنها امري بسيار ضروري است.
2-3- مناطق پراکنش جنس آژيلوپس
آژيلوپس‌ها از جمله اجداد وحشي گندم بوده و عمدتاً در جنوب نواحي مديترانه تا خاورميانه و آسياي مرکزي پراکنده‌اند [67]. مرکز اوليه آژيلوپس طبق بررسي‌هاي مختلف در هلال حاصلخيز بوده است، زيرا مقدار زيادي از گونه‌هاي آژيلوپس نسبت به مناطق ديگر در اين منطقه يافت مي‌شوند [116،114،15]. جنس آژيلوپس در درياي مديترانه، اروپا وجنوب اوکراين، همچنين کشورهاي مستقل مشترک المنافع و قفقاز، در آفريقا، شمال صحراي بزرگ آفريقا، در آسياي مرکزي و غربي، منطقه مرزي با بيابان هاي شبه جزيره عربستان در جنوب و با کوه تيان شان در شرق آسياي مرکزي رشد مي کنند [115،60]. اين گونه ها در زيستگاههايي با بارش ساليانه از 75 تا 1400 ميليمتر در سال و ارتفاعات مختلف از 400 تا 2700 متر يافت مي شوند [115،60]. همه گونه‌هاي ديپلوئيد آژيلوپس در مقايسه با گونه‌هاي پلي‌پلوئيد، دامنه پراکنش محدودتري دارند [54،9]. معمولاًگونه‌هاي آژيلوپس بيشتر در حاشيه جاده‌ها، مزارع و يا در داخل گياهان زراعي به صورت علف هرز يافت مي‌شوند [70].
2-4- مناطق پراکنش گونه Ae.crassa
آژيلوپس کراسا داراي درجه بالايي از تنوع مورفولوژي بوده است [115]. آژيلوپس کراسا در ترکيه، فلسطين، سوريه، اردن، ايران، عراق،لبنان، افغانستان، ترکمنستان و پامير و کوه‌هاي آلتاي پراکنده است، در ايران داراي دامنه پراکنش بسيار وسيعي بوده و از دامنه‌هاي البرز در شرق کشورتا شمال غرب در آذرباييجان غربي وبر روي دامنه‌هاي رشته‌کوه زاگرس تا سواحل جنوبي در ارتفاعات استان بوشهر وهرمزگان مي رويد [101،40]. اين گونه به عنوان يک منبع صفات مفيد از قبيل تحمل به شوري، مقاومت به آفت و تحمل به سرما شناخته شده است. اگرچه دامنه پراکنش و سازگاري اين گونه نسبت به گونه Ae.tauschii کمتر است، اما اين احتمال نيز وجود دارد که ژنوم D موجود در اين گونه حامل ژن‌هاي سازگاري متفاوتي بوده و با انتقال آن به ژنوم گندم‌هاي نان ارقامي با پايه ژنتيکي وسيع‌تر و دامنه سازگاري مطلوب‌تر توليد گردد [101،40]. با اين حال اين گونه به‌طور عمده در کوه‌هاي زاگرس در غرب ايران يافت مي‌گردد.
2-5- طبقه بندي گونه Ae.crassa
* سلسله15: گياهان
* بخش16: Spermatophytae
* شاخه17: Angiosperms
* رده18: Monocotyledoneae
* راسته19: Graminales
* تيره20: Gramineae يا Poaceae
* طايفه: Triticeae
* زيرطايفه: Triticineae
* جنس: Aegilops
* گونه:Crassa
2-6- تنوع ژنتيکي و اهميت شناخت آن
مطالعه تنوع ژنتيکي فرايندي است که تفاوت يا شباهت گونه‌ها، جمعيت‌ها و يا افراد را با استفاده از روش‌ها و مدل‌هاي آماري خاص براساس صفات مورفولوژيک، اطلاعات شجره‌اي يا خصوصيات مولکولي افراد بيان مي‌کند. تغييرات ژنتيکي در جمعيت‌هاي گياهي مي‌تواند بوسيله سازوکارهاي مختلف از قبيل جهش21، نوترکيبي ژنتيکي، مهاجرت22، جريان ژني23، رانده شدگي ژنتيکي24 و گزينش25 بوجود آيد. منبع اصلي تغييرات ژنتيکي جديد، تغييرات ژنتيکي حاصل از توليد آلل‌هاي جديد يا الل‌هاي تغييرشکل‌يافته با عمل ژني جديد با نام تغييرات جديد26 مي باشد. فرايندهاي ژنتيکي مختلف مانند کراسينگ‌آور نامساوي، نوترکيبي درون‌ژني، ترانسپوزون‌ها، متيله‌شدن DNA، پاراموتاسيون و تکثير‌ژني از عوامل مهم بوجودآورنده تغييرات جديد در مجموعه‌هاي ژرم‌پلاسمي است. يکي از پيامدهاي اجتناب‌ناپذير کشاورزي نوين که مبتني بر استفاده از واريته‌هاي اصلاح‌شده با حداکثر عملکرد و کيفيت قابل قبول مي باشد، کاهش تنوع ذخاير ژنتيکي بوده است. بنابراين آگاهي از تنوع ژنتيکي و مديريت منابع ژنتيکي به عنوان اجزاء مهم برنامه‌هاي اصلاح‌نباتات، تلقي مي‌گردند [85،15]. در مديريت حفاظت از ذخائر ژنتيکي، اطلاع از تنوع بين و درون‌گونه اي و زير‌گونه هاي مختلف کمک بزرگي به آگاهي از فرايندهاي تکاملي و ارزيابي خطرات احتمالي از قبيل خطر انقراض در يک گونه گياهي مي‌نمايد [26]. به عنوان مثال اطلاع از وضعيت تنوع ژنتيکي در گونه‌هاي مختلف اطلاعاتي را در رابطه با انتخاب راهکار مناسب براي حفاظت در در محل و خارج از محل ژنوتيپ‌هاي در حال انقراض ارائه مي‌نمايد. ساختار ژنتيکي گونه‌ها تحت تأثير عوامل مختلف اقليمي و الگوي پراکنشي مختلف در طول ساليان متمادي تغيير مي‌يابد [26]. بنابراين شناخت الگوي تنوع ژنتيکي گونه‌ها و زيرگونه‌ها مي‌تواند گامي مهم در جلوگيري از انقراض گونه‌ها، جلوگيري از رانده‌شدن ژنتيکي و توسعه کلکسيون هاي ذخائر ژنتيکي باشد [26]. همچنين مطالعه تنوع ژنتيکي جمعيت‌هاي يک گونه در برنامه‌ريزي طرح‌هاي به‌نژادي آتي آن حائز اهميت است [26].
2-7- منشاء تنوع ژنتيکي
تنوع بين گياهان يک گونه گياهي خاص بر دو نوع است، تنوع بر اثر محيط،که به مقادير مختلف تنش محيطي واکنش مي‌دهد و با مقايسه‌ي گياهان دو‌جمعيتي که از لحاظ ژنتيکي يکنواخت هستند، مي توان آن را مشاهده نمود. تأثير محيط روي يک گياه، به نتاج آن منتقل نمي‌شود و بنابراين انتخاب در يک جامعه ي يکنواخت ژنتيکي، به جدا نمودن نژادهايي که در واکنش به تنش‌هاي محيطي اختلاف دارند، نمي‌انجامد. دسته دوم تنوع ارثي است، اين نوع تنوع، به تنوع موجود در يک جمعيت مخلوط ژنتيکي، که از عوامل ارثي ناشي شده و به نتاج انتقال مي‌يابد، اطلاق مي‌گردد [6]. از آنجايي که اين نوع تنوع، ناشي از عوامل ارثي است و به نتاج قابليت انتقال دارد، لذا در اصلاح نباتات و برنامه‌هاي اصلاحي حائز اهميت است [6]. از منابع تنوع ارثي در گياهان مي توان نوترکيبي‌هاي ژنتيکي، تغييرات در کروموزوم‌ها و جهش‌ها را نام برد [3]. براي بررسي تنوع ارثي گياهان، از روش‌هاي مختلفي مي‌توان استفاده نمود. از جمله به کار بردن نشانگرها مثل نشانگرهاي مورفولوژيک، نشانگرهاي بيوشيميايي و نشانگرهاي DNA مي‌باشد.
2-8- اهميت بررسي تنوع ژنتيکي
اندازه‌گيري تنوع ژنتيکي در جهت بررسي دو دسته از مشکلات مفيد خواهد بود يکي آزمايش نظريه هاي موجود در رابطه با ماهيت عوامل موثر بر تنوع ژنتيکي که به آنها اصطلاحأ هسته‌هاو لکه‌هاي تکامل گفته مي‌شود و ديگري استفاده از معيارهاي تنوع ژنتيک به عنوان ابزاري براي شناخت روابط ميان ارگانيسم‌ها و همچنين تنوع موجود در داخل و بين آنها.از سوي ديگر به نژادي بر دو اصل تنوع و انتخاب پايه‌گذاري شده است. تنوع ژنتيکي آستانه تحمل يک گونه را در برابر تنش‌هاي زيستي و غيرزيستي بالا مي‌برد. در هر برنامه به‌نژادي وجود تنوع ژنتيکي و سودمند بودن واريانس قابل گزينش آن از عوامل عمده در موفقيت محسوب مي‌شود، چرا که پرهزينه‌ترين بخش براي ايجاد هيبريدي با عملکرد بالاتر، انتخاب والدين مناسب مي‌باشد. بنابراين روشي که بتواندشناسايي مطلوب‌تري را فراهم نمايد در پيش‌برد اهداف طرح حائز اهميت است [19].
2-9-کاربردهاي بررسي تنوع ژنتيکي
بررسي تنوع ژنتيکي موجود در ژرم‌پلاسم يک گونه زراعي هم در طرح‌هاي به‌نژادي و هم حفاظت از منابع ژنتيکي کاربرد دارد [111]. به‌طور کلي تعيين تنوع ژنتيکي در زمينه اداره مجموعه‌هاي گياهي، نگهداري و حفاظت، درج مشخصات و استفاده از مجموعه‌هاي گياهي به ما کمک مي‌کند. بعضي از جنبه‌هاي معمول اين کاربردها به شرح زير است.
2-9-1- بررسي هاي فيلو ژنتيکي
بررسي‌هاي فيلوژنتيکي به‌منظور بررسي روند تکاملي گياهان به کار مي‌رود. جمعيت‌هاي گياهي فعلي بر اين اساس طبقه‌بندي شده‌اند که نحوه پيدايش آن‌ها از اجدادشان را نشان مي‌دهد. ارزش عملي چنين بررسي‌هايي در استفاده از آن اطلاعات در به‌گزيني ژنتيکي گياهان است. با دانستن روابط ژنتيکي بين گياهان، از اطلاعات رده‌بندي مي‌توان به عنوان راهنمايي براي بهره‌برداري از منابع ژنتيکي در استفاده از آن‌ها در تلاقي‌ها و جداسازي ژن‌هاي مفيد استفاده کرد [12].
2-9-2- ژنتيک جمعيت
از ژنتيک جمعيت‌هاي گياهي مي‌توان در تعيين فاکتورهايي نظير قدرت انتخاب در محيط محلي، سرعت حرکت ژن‌ها بين ريز‌جمعيت ها و رانده‌شدن ژنتبکي مرتبط با تغييرات تکاملي استفاده نمود. درک اين عوامل در مديريت موثر جمعيت‌هاي گياهي وحشي سودمند است [12].
2-9-3- مديريت گياهان وحشي
بررسي تنوع ژنتيکي در جمعيت‌هاي نادر يا گياهان در حال انقراض، امکان مديريت جمعيت‌هاي گياهي را جهت حفظ تنوع ژنتيکي فراهم نموده وممکن است در اطمينان به بقاي طولاني‌مدت گونه‌ها کمک کند. مطالعه مشابهي در جمعيت علف‌هاي هرز ممکن است در مديريت آن‌ها براي به حداقل رساندن اندازه جمعيت به کار رود. تشکيل گونه‌ها در گياهان در اثر ايجاد تفاوت‌هايي در جمعيت‌هاي گياهي اتفاق مي‌افتد که به جداي توليد مثل منجر مي‌گردد [12]

2-9-4- مديريت منابع ژنتيکي
تعداد گونه‌هاي گياهي تقريبأ 250 هزار گونه تخمين زده مي‌شود. حفاظت منابع ژنتيکي اين تعداد گونه هدف کلاني است [3]. تعداد نسبتأ کمي از اين گونه‌ها توسط بشر مصرف مي‌شود و شمار خيلي محدودي به صورت زراعي درآمده است. سه گونه گندم، ذرت و برنج حدودأ نصف غذاي بشر را تأمين مي‌کنند و نگهداري منابع ژنتيک گياهان مهم زراعي جهت امنيت غذايي بشر ضروري است.
2-9-4-1-کلکسيون هاي ذخائر ژنتيک گياهي
اکثر ذخائر ژنتيک گياهي در خارج از محيط طبيعي به صورت کلکسيون‌هاي بذر هستند. مزيت کلکسيون‌هاي بذر عمومأ افزايش طول عمر بذر با نگهداري در دما و رطوبت پايين است. اين روش براي همه ي گونه‌هاي گياهي مناسب نيست. براي برخي گونه‌ها مي‌توان از روش کشت بافت يا نگهداري در دماي پايين استفاده کرد. به دلايل مختلف نمونه‌هاي ژرم‌پلاسم در مزارع يا باغ‌ها نگهداري مي‌شوند که البته به شرايط نامسائد محيطي آسيب‌پذيرند. نگهداري ذخائر ژنتيک گياهي به‌صورت DNA به دليل هزينه نسبتأ کم و طولاني مدت بودن داراي مزيت است. در اين روش تعداد زيادي نمونه در حجم نسبتأکم قابل نگهداري است. بررسي‌هاي مولکولي تنوع ژنتيکي در کلکسيون‌هاي ذخائر گياهي سبب مديريت بهتر آن‌ها شده است، بويژه در مواردي که محدوديت منابع و فضا وجود دارد [3].
2-9-4-2-کنترل بيماري هاي گياهي
آگاهي از تنوع ژنتيکي در عوامل بيماري‌زايي گياهي اهميت زيادي در کنترل بيماري‌هاي گياهي دارد [3]. در اصلاح براي گياهان مقاوم به بيماري با مقاومت پايدار، ضروري است که گياهان به همه ژنوتيپ‌هاي عامل بيماري‌زا مقاوم باشند. عوامل بيماري‌زا که از نظر ژنتيکي يکنواخت هستند احتمال موفقيت بيشتري را در ايجاد مقاومت پايدار از طريق گسترش تک ژن هاي مقاوم ارائه مي‌دهند. با شناخت مقدار تنوع ژنتيکي عوامل بيماري‌زا در نواحي مختلف مي‌توان قرنطينه بيماري‌هاي گياهي را بهتر ارائه کرد. مطالعه تنوع ژنتيکي در عوامل بيماري‌زا ممکن است اطلاعاتي را در خصوص منشاء عوامل بيماري‌زا و الگوي پراکنش آن ها در اختيار قرار دهد که در اثر عوامل انساني و محيطي بوجود مي‌آيد [3].
2-10- روش هاي ارزيابي تنوع ژنتيکي
جهت ارزيابي و برآورد تنوع ارثي گياهان، مي توان روش‌هاي مختلفي را بکار برد. از جمله اين روش‌ها به کار بردن انواع نشانگرها، همانند نشانگرهاي مورفولوژيک27، نشانگرهاي بيوشيميايي و نشانگرهاي DNA است. در بين اين روش‌ها نشانگرهاي DNA دقيق‌ترين و مطمئن‌ترين نشانگرها، جهت تعيين و شناسايي تنوع محسوب مي‌شوند.
2-11- نشانگرهاي ژنتيکي
فنوتيپ هرگياه توسط ترکيبي از عوامل ژنتيکي و محيطي تعيين مي‌گردد. نشانگرهاي ژنتيکي داراي جايگاه خاصي روي يک کروموزوم هستند که به عنوان نشانگرهاي اختصاصي براي تجزيه وتحليل‌هاي ژنومي به خدمت گرفته مي‌شوند. در واقع تفاوت موجود بين رديف DNA کروموزوم‌هاي هر سازواره که از افراد به نتاج آن‌ها منتقل مي‌گردد، مي‌تواند به عنوان نشانه يا نشانگر ژنتيکي به کار گرفته شود. اين تفاوت مي‌تواند به طرق متفاوتي تظاهر يابد. توارث مشترک يا لينکاژ ژنتيکي ژن مورد نظر در اصلاح‌نباتات (به عنوان مثال ژن مقاومت) و نشانگر، بيان مي کند که آن دو از نظر فيزيکي نزديک هم بوده و بر روي يک کروموزوم قرار دارند. براي آن که نشانگري به عنوان نشانگر ژنتيکي استفاده شود بايستي حداقل ويژگي‌هاي زير را داشته باشد:
* در بين دو فرد متفاوت باشد (چند شکلي28 نشان دهد)


پاسخ دهید