3-4-2- مواد و وسايل لازم جهت کشت نمونه……………………………………………………………..46
3-4-3- کشت در محيط جامد انتخابي…………………………………………………………………………47
3-5- آزمون هاي بيوشيميايي………………………………………………………………………………………47
3-5-1- کشت در محيط آهن دار سه قندي…………………………………………………………………..47
3-5-2- آزمون اوره آز……………………………………………………………………………………………… 48
3-5-3- آزمون وژس پروسکوئر………………………………………………………………………………….48
3-5-4- آزمون اندول…………………………………………………………………………………………………..49
3-5-5- آزمون سيترات………………………………………………………………………………………………49
3-5-6- آزمون حرکت………………………………………………………………………………………………..49
3-6- آزمون رنگ آميزي گرم……………………………………………………………………………………..49
3-6-1- تهيه گسترش روي لام…………………………………………………………………………………..50
3-6-2- رنگ آميزي با کريستال ويوله…………………………………………………………………………50
3-6-3- مرحله شستشو……………………………………………………………………………………………..51
3-6-4- مرحله اضافه کردن محلول يد…………………………………………………………………………51
3-6-5- مرحله رنگ بري با استفاده از استن – الکل………………………………………………………51
3-6-6- رنگ آميزي با فوشين…………………………………………………………………………………….51
3-6-7- خشک کردن لام……………………………………………………………………………………………51
3-6-8-نکات مهمي که هنگام رنگ آميزي گرم بايد مورد توجه قرار گيرد ………………………51
3-7- استخراج DNA………………………………………………………………………………………………52
3 -7-1- مواد و وسايل لازم……………………………………………………………………………………..52
3-8- آزمون PCR………………………………………………………………………………………………….. 52
3-8-1- مواد و وسايل لازم……………………………………………………………………………………….52
3-8-2- روش کار……………………………………………………………………………………………………53
3-9- الکتروفورز محصولاتPCR………………………………………………………………………………54
3-9-1- مواد و وسائل لازم……………………………………………………………………………………….54
3-9-2- تهيه بافر 1x………………………………………………………………………………………………..55
3-9-3- تهيه ژل آگاروز……………………………………………………………………………………………55
3-8-4- بارگذاري محصولات ……………………………….PCR…………………………55
3-10- مشاهده باند هاي روي ژل………………………………………………………………………………56
3-10-1- مواد و وسايل لازم…………………………………………………………………………………….56
فصل چهارم :نتايج
4-1 نتايج………………………………………………………………………………………………………………..58
4-2- کشت در محيط جامد انتخابي……………………………………………………………………………58
4-2-1- کشت در محيط XLD ………………………………………………………………………………..58
4-2-2-کشت در محيط سالمونلا شيگلا آگار……………………………………………………………….59

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

4-3-آزمون گرم………………………………………………………………………………………………………..59
4-4-تست هاي بيو شيميايي…………………………………………………………………………………………..60
4-4-1-آزمون .TSI……………………………………………………………………………………………………..60
4-4-2-آزمون اوره آز………………………………………………………………………………………………….60
4-4-3-آزمون ..VP…………………………………………………………………………………………………61
4-4-5-آزمون اندول…………………………………………………………………………………………………….61
4-4-6-آزمون سيترات………………………………………………………………………………………………… 61
4-4-7-آزمون حرکت…………………………………………………………………………………………………..62
4-5-استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………..63
4-5-1-استخراج توسط KOH 5/0 مولار………………………………………………………………………63
4-6-آزمونPCR…………………………………………………………………………………………………………63
4 -7-نتايج آزمون کاي دو……………………………………………………………………………………………67
فصل پنجم : بحث و پيشنهادات
5-1- بحث………………………………………………………………………………………………………………..69
5-2- نتيجه گيري نهايي………………………………………………………………………………………………77
5-3-پيشنهادات………………………………………………………………………………………………………….78

فهرست شکل ها:
شکل 3-1-1-دستگاه الکتروفورز………………………………………………………………………………45
شکل 3-1-2-دستگاه ترموسايکلر……………………………………………………………………………..45
شکل 3-1-3-ترازوي ديجيتال………………………………………………………………………………….45
شکل 3-1-4-اتوکلاو………………………………………………………………………………………………45
شکل 3-1-5-انکوباتور……………………………………………………………………………………………45
شکل 3-2 آزمون ………………………………………VP………………………..48
شکل 4-1پرگنه هاي سالمونلاي جداشده از نمونه هاي مدفوعي در محيط ss آگار………………….59
شکل 4-2 پرگنه هاي سالمونلاي جداشده از نمونه هاي مدفوعي در محيط XLD……………………59
شکل 4-3:رنگ آميزي گرم سالمونلا…………………………………………………………………………..60
شکل 4-4 تست TSI نمونه هاي سالمونلا………………………………………………………………….60
شکل4-5:آزمون اوره آز……………………………………………………………………………………………..61
شکل 4-6 تست سيترات نمونه هاي سالمونلا……………………………………………………………..62
شکل4-7:استخراج DNA………………………………………………………………………………………..63
شکل 4-8 نتيجه آزمايش …………………….Multiplex PCR………………………65

فهرست جدول ها:
جدول 3-1 اجزاي واکنش PCR………………………………………………………………………52
جدول3-2: برنامه دمايي PCR در شناسايي سالمونلا………………………………………….53
جدول 3-3 مشخصات پرايمر هاي مورد استفاده………………………………………………….54
جدول 4-1: جدول دمايي و زماني ………………………PCR………………….64
جدول 4-2 آزمون کاي دو……………………………………………………………………………….67

فهرست نمودارها:
نمودار شماره 1-4 درصد آلودگي نمونه هاي مدفوع به باکتري سالمونلا به روش معمول جداسازي………………. 66
نمودار شماره2-4: درصد آلودگي نمونه هاي مدفوع به باکتري سالمونلا به روشM-PCR ……………………… 66

چکيده
چكيده:
عفونت‌هاي سالمونلايي كه عفونت هاي غذايي ناميده مي‌شوند، ممكن است توسط هر يك از سرووارها ايجاد شود. معمولا باكتري عامل عفونت در ماده غذايي رشد مي‌كند تا به مقدار قابل توجهي برسد. به اين ترتيب احتمال عفونت افزايش يافته و موجب بروز بيماري در خانواده‌ها و گروه‌هاي بزرگ مي‌شوند. سالمونلا و سروتيپ‌هاي آن منبع مهم آلودگي‌هاي غذايي انسان و عامل پاتوژن بسيار قوي و بيماري‌زا در انسان‌هاست. سالمونلا باكتري گرم منفي، متحرك و باسيلي شكل است كه خصوصيات عمومي خانواده انتروباكترياسه را داراست. امروزه بيش از 2450 سروتيپ سالمونلا شناسايي شده است كه برخي از اين سروتيپ‌ها عامل بيماري‌هايي از قبيل تب تيفوئيد و انتروكوليت در انسان مي‌باشند. در اين مطالعه 50 نمونه مدفوع افراد مبتلا به اسهال از سطح بيمارستان‌هاي شهرستان سبزوار جمع‌آوري گرديد و با رعايت كامل موارد بهداشتي به آزمايشگاه تخصصي دانشگاه آزاد اسلامي واحد سبزوار منتقل شدند. براي جداسازي اوليه از محيط كشت‌هاي بافر پپتون واتر ، سلنيت F براث ،XLD و SS آگار استفاده گرديد. جهت تاييد تشخيص از تست‌هاي بيوشيميايي نظير TSI و اوره آگار و VP، اندول و سيمون سيترات و حرکت استفاده شد. در مطالعه حاضر 10 مورد باكتري سالمونلا با استفاده از روش كشت ميكروبي جدا شد. اين در حالي است كه با استفاده از روش مولكولي Multiplex PCR ، 21 مورد باكتري سالمونلا در نمونه‌ها رديابي گرديد. بنابراين مي‌توان گفت كه روش PCR نسبت به كشت ميكروبي از دقت بالاتري برخوردار است و همچنين روش‌هاي سنتي كشت ميكروبي اغلب زمان‌بر خسته‌كننده و پرهزينه است.
واژه‌هاي كليدي: سالمونلا ، Multiplex PCR ، مدفوع

فصل اول
مقدمه
مقدمه و هدف:
در طول دهه گذشته وقوع بيماري‌ها و عفونت هاي با منشا غذايي نه تنها در كشورهاي در حال توسعه و با فقر بهداشتي، بلكه در كشورهاي توسعه يافته و با استانداردهاي بالاي بهداشتي نيز رو به افزايش بوده و اين در حالي است كه وقوع عفونت‌ها و مسموميت‌هاي غذايي اغلب گزارش نشده باقي مي‌ماند و لذا تعيين آمار دقيق از ميزان ابتلا خصوصاً در كشورهاي درحال توسعه امكان‌پذير نمي‌باشد. غذا مي‌تواند به عنوان يك حامل، بسياري از ميكروارگانيسم‌هاي عامل عفوني يا غير عفوني را در خود حمل کند که در بعضي از شرايط، رشد عامل عفوني را حمايت کرده و به عنوان ناقل فعال عمل نموده و يا تنها نقش ناقل غيرفعال را ايفا مي‌نمايد كه در اين صورت عامل عفونت در غذا رشد ننموده و يا تنها به وسيله‌ي غذا به انسان منتقل مي‌شود. بيماري‌هاي غذايي جزء بيماري‌هاي روده‌اي تقسيم‌بندي مي‌شوند كه از نظر اهميت در آمريكا بعد از بيماري‌هاي ريوي در مقام دوم قرار دارند. در يك بررسي در ايالات متحده گزارش شده كه بطور مستقيم هر آمريكايي حداقل هر سال يكبار به بيماري‌هاي روده‌اي با علامت اسهال مبتلا مي‌شوند. گفته مي‌شود كه اين مسئله به خاطر ناسالم بودن غذاي توليد شده در اين كشور نيست بلكه مردم با عمل‌آوري غلط و غيربهداشتي و يا از طريق انتقال عوامل عفوني خود غذا را ناسالم مي‌كنند (مهرور و همکاران،1385).
برطبق مطالعات انجام شده همه ساله بيش از هزار ميليون مورد اسهال حاد در بين بچه‌هاي زير پنج سال در كشورهاي آمريكا، آسيا (به استثناي چين) و آمريكاي لاتين اتفاق مي‌افتد كه به مرگ بيش از پنج ميليون نفر منجر مي‌گردد. در كشورهاي صنعتي مشكل كمتر از اين‌هاست ولي به طور معنادار هنوز از اهميت خاصي برخوردار است. طبق گزارش‌هاي موجود تنها در يك همه‌گيري آن هم در كشوري مثل آمريكا بيش از 15000 نفر در اثر مصرف شيرآلوده به سالمونلاي مقاوم به آنتي‌بيوتيك مبتلا شدند. باكتري‌ها به عنوان مهم‌ترين عوامل در بروز بيماري‌هاي ناشي از مصرف غذا مي‌باشند(اردستاني و همکاران،1386). از جمله اين عوامل بيماري‌زا خانواده انتروباكترياسه است(تاجبخش،1386). خانواده انتروباكترياسه از تعداد زيادي باكتري گرم منفي تشكيل شده كه قرابت بسياري با هم دارند و در آب و خاك و مواد در حال فساد و گياهان و دستگاه گوارش انسان و حيوانات و حشرات يافت مي‌شوند. از آن جا كه جايگاه اصلي و طبيعي اين باكتري‌ها روده انسان و حيوانات مي‌باشد اصطلاحاً آنها را باسيل‌هاي روده‌اي يا انتريك مي‌نامند. باكتري‌هاي جنس سالمونلا گرم منفي، هوازي و بي‌هوازي اختياري، باسيلي شكل به اندازه‌ي 5-2 × 5/1 – 7/0 ميكرون هستند که خصوصيات عمومي خانواده انتروباكترياسه را دارا مي‌باشند (تاجبخش،1376).
از لحاظ شرايط رشد اين ميكروارگانيسم‌ها باكتري‌هاي انعطاف‌پذيري بوده و به آساني با شرايط محيطي خود را هماهنگ مي‌كنند. اين جنس از ميكروارگانيسم‌ها به حرارت حساسند. در درجه حرارت‌هاي پائين امكان بقاي آنها بيشتر است. اكثر سروتيپ‌هاي سالمونلا پاتوژن‌هاي بالقوه براي انسان و بسياري از حيوانات مي‌باشند. اين باكتري در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهي ها سيطره پيدا کرده و بسته به سروتيپ، شرايط و عوامل متعدد ميزباني ، بيماري‌هايي با نشانه‌هاي گوناگون و عوارض متفاوت ايجاد مي‌كنند(زهرايي صالحي،1388). اين باكتري‌ها معمولاً از طريق مدفوع انسان يا دام دفع شده و باعث آلودگي آب و غذا و محيط مي گردند. انسان و حيوانات در بيشتر موارد در اثر مصرف اين‌گونه مواد آلوده، باكتري را وارد دستگاه گوارش خود كرده و در نتيجه اين گردش دهاني – مدفوعي تداوم مي‌يابد(زهرايي صالحي،1388). باكتري سالمونلا انتريكا مهم‌ترين عامل در ابتلا به بيماري سالمونلوز در انسان مي‌باشد به طوري كه شيوع عفونت‌هاي سالمونلا انتريتيديس به خصوص در دهه‌ي اخير افزايش يافته است. فرد آلوده با سرووارهاي سالمونلا انتريكا اغلب مبتلا به تب، دردهاي ماهيچه‌‌هاي شكمي و اسهال مي‌باشد. شروع اين علائم از 12 ساعت تا يك هفته پس از مصرف غذاي آلوده ادامه دارد. اين بيماري اغلب 4 تا 7 روز به طول مي‌انجامد در بسياري از افراد بدون درمان با آنتي‌بيوتيك بهبود مي‌يابند. با اين حال، اسهال مي‌تواند شديد و گاهي اوقات منجر به بستري شدن افراد در بيمارستان گردد. بيماري در شيرخواران، كودكان و همچنين افراد مسن شدت داشته و نگران‌كننده مي‌باشد. در مواردي بيماري مي‌تواند به مرگ و مير در افراد حساس منجر شود(يوسفي مشعوف و همکاران ،1380) .
امروزه در آزمايشگاه‌هاي ميكروب‌شناي از سه روش رايج جهت شناسايي و تشخيص باكتري استفاده مي‌شود.

1- روش كشت سنتي و بيوشيميايي كه با تهيه نمونه و تهيه محيط كشت و تشخيص باكتري استفاده مي‌شود.
2- روش‌ها سرولوژيكي: برپايه تشخيص آنتي‌ژن‌هاي توليد شده توسط باكتر (آنتي‌ژن O و H) است.
3- روش‌هاي مولكولي: واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز (PCR) يكي از رايج‌ترين روش‌هاي مولكولي است كه بر اساس حضور ژن خاص و يا به عبارت ديگر قطعه‌اي از DNA است در اين روش قطعه‌اي از ژن هدف تشكيل شده و وجود عامل پاتوژن اثبات مي‌گردد. چندين ژن هدف در سويه‌هاي سالمونلا وجود دارد(,…,( InvA, spvC, InvB, OmpC(کارلسون و همکاران، 2004).
ژن InvA كه براي تهاجم باكتري سالمونلا لازم است و بوسيله آن باكتري به قسمت‌هاي عمقي‌تر روده نفوذ مي‌كند براي جنس سالمونلا اختصاصي است(گورين و همکاران،2005).
در اين تحقيق كه در دانشگاه آزاد اسلامي واحد سبزوار انجام گرفت بر روي نمونه‌هاي كلينيكي (مدفوع) با استفاده از محيط‌هاي اختصاصي سالمونلا و سپس با روش مولكولي Multiplex PCR به شناسايي عوامل پاتوژني سالمونلا پرداختيم. هدف از اين مطالعه ارزيابي تناسب ژن invA ،ompC و rfs به وسيله Multiplex PCR ،به عنوان روش اختصاصي براي تشخيص برخي از سرووارهاي سالمونلا انتريکا در نمونه هاي کلينيکي (مدفوع)بود . همچنين مقايسه روشPCR با روش هاي کشت سنتي و اختصاصي براي تشخيص سالمونلا بود.

فصل دوم
مروري بر تحقيقات گذشته

2-1-خصوصيات سالمونلا :
2-1-1-تاريخچه :
بيماري هاي ناشي از سالمونلا در انسان و حيوانات از زمانهاي قديم وجود داشته ولي تشخيص تفريقي آن از ساير بيماري ها مشكل بوده است. در جلد اول و دوم كتاب ارزشمند تاريخ دامپزشكي و پزشكي ايران تأليف استاد گرانقدر جناب آقاي دكتر حسن تاج‌بخش به بيماري حصبه، تب مُطِبِقه و تب تيفوئيد اشاره شده است. در اوايل قرن 19 دو دانشمند فرانسوي به نامهاي لوئي1 و كومل2 نشانه هاي باليني و كالبدگشاي تب تيفوئيد را مورد بررسي قرار دادند(زهرايي صالحي،1388).
در سال 1837 گرهارد3 در اپيدمي تيفوس در فيلادلفيا دو بيماري تيفوس و تيفوئيد را از هم متمايز ساخت. ادوارد جنر4 در بين سالهاي 1849ـ1851 در بريتانيا از روي تجزيه و تحليل نشانه‌هاي بيماري‌هاي تب‌دار، تب تيفوئيد را تشخيص داد(زهرايي صالحي،1388).
ويليام باد5 در طي 1856ـ1873 نشان داد كه تب تيفوئيد بيماري است عفوني و از طريق مدفوع انسان و حيوانات و آب آلوده انتقال مي‌يابد. در حال حاضر اين باكتري به عنوان سالمونلا تيفي شناخته مي‌شود. همچنين اين باكتري در سال 1885 توسط فيفر6 از مدفوع، در سال 1886 توسط هوپ7 از ادرار و در سال 1888 توسط ويلچور8و فون و ون‌فوتري9 از كيسه صفرا، در سال 1907 بوسيله كانرادي10 از فرد مبتلايي در دوره كمون بيماري جدا گرديد. در سال 1885 اسميت و سالمون جرمي را از خوك جدا كردند. بعدها نام اين جرم را سالمونلا كلراسويس گذاشتند(زاپور و دولي،2005). در سال 1888 جرم ديگري توسط گارتنر11 از فردي كه در اثر گاستروانتريت ناشي از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آنرا باسيلوس انتريتيديس ناميد كه بعداً سالمونلا انتريتيديس خوانده شد(آدامز و موس، 2000). لوفلر12 در سال 1982 از بيماري مشابه تب تيفوئيد در موش جرمي را جدا كرد و آنرا باسيلوس تيفي موريوم نامگذاري كرد(داويس و واري، 1996). نوبل13 در سال 1989 و وري14 در سال 1908 جرم مشابهي را از خوكچه هندي جدا كردند كه بعداً سالمونلا تيفي موريوم ناميده شد. سالمونلاگاليناروم15اولين‌بار بوسيله كلين16در سال 1889 و سالمونلا پولوروم به وسيله رتگر17در سال 1900 مورد شناسايي قرار گرفت(هاوستاد ،1972). لينير18 در سال 1900 خواص اجرام مربوط به پاراتيفوئيد B , A را مورد بررسي قرار داد و متوجه گرديد كه اين ارگانيسم‌ها شبيه باكتري‌هاي جدا شده توسط سالمون هستند به همين جهت به افتخار اولين كاشف اين باكتري‌ها پيشنهاد كرد كه آنها را سالمونلا بنامند. دانيل سالمون پاتولوژيست بود كه اولين بار سالمونلا را از روده خوك جدا كرد(تاجبخش،1382). در فاصله بين سالهاي 1925ـ1900 بزرگترين رويداد در كشف سرولوژيكي آنتي‌ژن‌هاي سوماتيك و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسيله ليگنيرز19 انجام شد(تاجبخش، 1385).در سال 1926 تركيبات پادگني سالمونلا طبقه‌بندي گرديد و جدولي به نام جدول كافمن ـ وايت ايجاد شد. در حال حاضر اين جدول داراي حدود 2500 سروتيپ است(کافمن، 1971) .

2-1-2- طبقه‌بندي:
خانواده آنتروباكترياسه از تعداد زيادي باكتري گرم منفي تشكيل شده كه قرابت بسياري با هم دارند(داويس و واري،1996).
در آب و خاك و مواد در حال فساد و گياهان و دستگاه گوارش انسان و حيوانات و حشرات يافت مي‌شوند. از آنجا كه جايگاه اصلي و طبيعي اين باكتري‌ها روده انسان و حيوانات مي‌باشد اصطلاحاً آنها را باسيل‌هاي روده‌اي يا انتريك 20مي‌نامند(بروکس و همکارارن ،1995). برخي از اعضاي اين خانواده نظير شيگلا21، سالمونلا22 و يرسينيا23 بيماريزاي واقعي مي‌باشند در صورتي‌كه برخي ديگر نظير بعضي از سويه‌هاي اشريشياكلي24، كلبسيلا25، و پروتئوس26 جزء فلور طبيعي انسان و حيوانات بوده و در شرايط خاص بيماريزايي شوند. در حال حاضر بيش از 28جنس و 86 گونه در اين خانواده وجود دارد ولي خوشبختانه تنها حدود 25 گونه از باكتري‌هاي خانواده انتروباكترياسه پاتوژن‌هاي مهمي براي انسان و حيوانات بوده و از نمونه‌هاي مرضي جدا مي‌شوند(آلکامو، 1997).
2-1-3-خصوصيات ماكروسكوپيك و ميكروسكوپيك:
سالمونلاها باسيل‌هاي گرم منفي به اندازه 5ـ2 × 5/1ـ7/0 ميكرون هستند كه متعلق به خانواده انتروباكترياسه‌اند. اكثر سروتيپ‌هاي سالمونلا به استثناي سالمونلا پولوروم و سالمونلاگاليناروم و موتان‌هاي غيرمتحرك (تغيير ) كه گاهي اوقات در ساير سروتيپ‌ها ديده مي‌شود متحرك بوده و داراي تاژك از نوع اطرافي هستند. سالمونلاها به مواد شيميايي تمايل بسيار زيادي دارند و توانايي دارند مواد مغذي را هم از راه تخمير و هم از راه هوازي به مصرف برسانند.(شيمي،1386).سالمونلاها در روي محيط‌هاي عادي آزمايشگاهي در درجه حرارت c ْ15ـ45 رشد مي‌كنند ولي درجه حرارت مناسب براي رشدشان c ْ37 است. از لحاظ شرايط رشد اين ميكروارگانيسم‌ها باكتري‌هاي انعطاف‌پذيري بوده و به آساني با شرايط محيطي خود را هماهنگ مي‌كنند(مرتضوي و همکاران،1382). اكثر سالمونلاها در روي آگار مغذي بعد از 24 ساعت پرگنه‌هايي به قطر 3ـ2 ميلي‌متر، سفيد، خاكستري، مرطوب، كروي، مسطح، برجسته و صاف ايجاد مي‌كنند كه شبيه پرگنه‌هاي بسياري ديگر از باكتري‌هاي خانواده انتروباكترياسه است. اندازه و درجه كدورت پرگنه‌ها به نوع سروتيپ نيز بستگي دارد. برخي از سويه‌هاي بعضي از سروتيپ‌هاي سالمونلا پرگنه‌هاي فوق‌العاده ريزي (كمتر از 3/0 ميلي‌متر) توليد مي‌كنند كه اين موضوع اولين‌بار توسط ژاكوبسن 27در سال 1910 در سويه‌هايي از سالمونلا تيفي شناسايي شد ولي بعداً در بسياري از سروتيپ‌هاي ديگر نيز مشاهده گرديد. سالمونلا‌ها در PH 5/4 تا 5/9رشد مي‌كنند اما مناسب‌ترين PH براي رشد آنها 5/7ـ5/6است. غلظت‌هاي بالايي از نمك باعث مي‌گردند كه از رشد سالمونلا جلوگيري شود و اين به دليل كاهش آب قابل دسترسي (aw) است ( اوست ،1991).
اين باكتري اكسيداز منفي و كاتالاز مثبت بوده و از سيترات به عنوان منبع كربن استفاده مي‌كند. از توليدات اين باكتري ليزين در كربوكسيلات، سولفات هيدروژن وارنيتين مي‌باشد. (کويين و همکاران، 1994)از ديگر ويژگيهاي بيوشيميايي اين است كه اكثر سالمونلاها عدم توليد اندول، عدم توليد آنزيم‌هاي اوره آز، ليپاز، دزاكسي ريبونوكلئاز، فنيل‌آلانين و تريپتوفان دآميناز، دكربوكسيلاسيون اسيدهاي آمينه ليزين، اورنيتين و آرژنين، واكنش مثبت در آزمايش متيل‌رد(MR) و واكنش منفي در آزمايش وژس ـ پروسكوئر (VP)مثبت مي‌باشد. بسياري از توليدات پايه تشخيص بيوشيميايي در جداسازي سالمونلا مي‌باشند. همچنين اين باكتري در محيط آهن‌دار TSI، اسيد و گاز از گلوكز توليد مي‌كند ولي از ساكارز و لاكتوز اين محيط استفاده نمي‌كند. همچنين اين باكتري قادراست نيترات را به نيتريت احيا كند (مرتضوي و همکاران،1382).
از محيط‌هاي غني كننده مي‌توان براي جداسازي سالمونلاها از مدفوع، فاضلاب، غذا و ساير مواد داراي بار باكتريايي استفاده كرد. مزيت اين محيط‌ها اين است كه مي‌توان مقادير زيادي از مواد آلوده را به آنها تلقيح نمود به طوري‌كه امكان جداسازي سالمونلاها در مواردي كه تعداد آنها كم است فراهم شود. لازم به ذكر است كه در جداسازي سالمونلاها از مواد غذايي و محيط، قبل از مرحله غني‌سازي معمولاً نمونه‌ها را در محيط‌هاي احياكننده28 نظير لاكتوز براث و آب‌پپتونه تامپونه29 كشت مي‌دهند(روي و همکاران،2002).
انواع محيط‌هاي غني كننده مي‌توان به آبگوشت تتراتيونات30 آبگوشت سلنيت F، آبگوشت را پاپورت (حاوي كلريدمنيزيم و سبزمالاشيت)31 و آبگوشت سلنيت سيستين32 اشاره كرده معمولاً بعد از 24ـ18 ساعت از محيط‌هاي غني كننده روي محيط‌هاي انتخابي جامد كشت مي‌دهند. از محيط‌هاي انتخابي و تفريقي33 مي‌توان به محيط مك‌كانكي34 و محيط سالمونلا ـ شيگلا35 ، محيط سبز درخشان36، محيط آهن ليزين‌دار 37، محيط داكسي كلات سيترات يا محيط ليفسون(DCA)38 و محيط هكتوئن39 و محيط داكسي كلات ـ ليزين ـ گزيلور40 اشاره كرد. محيط بيسموت سولفات آگار41، نيز به عنوان محيط انتخابي براي جداسازي سالمونلا مورد استفاده قرار مي‌گيرد چرا كه قدرت انتخابگري اين محيط بالاست.42 اين باكتري‌ها معمولاً كربوهيدرات را با توليد اسيد و گاز تخمير مي‌كنند(داويس و همکاران1998).
سالمونلاتيفي، سالمونلاگاليناروم و بندرت واريانت‌هايي از سروتيپ‌هاي ديگر نظير سالمونلا تيفي موريوم و دابلين گاز ايجاد نمي‌كنند. سالمونلاها قندهاي گلوكز، مانيتول، آرابينوز، مالتوز، دولسيتول و سوربيتول را تخمير مي‌نمايند ولي قادر به تخمير لاكتوز، ساكارز، ساليسين و آدونيتول نيستند، البته استثناهايي هم وجود دارد مثلاً سالمونلا كلراسويس و برخي از سويه‌هاي سالمونلا تيفي آرابينوز را تخمير نمي‌كنند(زهرايي صالحي،1388).
2-1-4-حساسيت به مواد شيميايي:
شواهد زيادي مبني بر مقاومت سالمونلاها نسبت به مواد شيميايي مختلف وجود دارد كه خود پايه و اساس تلاشهاي بسياري براي تهيه محيط‌هاي غني كننده و انتخابي جهت جداسازي اين باكتري‌ها از نمونه‌هاي آلوده بوده است. استفاده از رنگ‌ها بويژه رنگهاي گروه تري‌فنيل‌آمين (سبزمالاشيت و سبز درخشان) كه ممانعت كننده‌هاي مناسبي هستند از سالهاي دور شناخته شده است(زهرايي صالحي،1388).
بسياري از سالمونلاها در c ْ43 رشد مي‌كنند وانكوباسيون محيط‌هاي غني‌كننده نظير سلينت F و را پاپورت و اسيلياديس (RV) در اين درجه براي جداسازي سالمونلاها توصيه شده است( زهرايي صالحي،1388).
سالمونلاها همچنين نسبت به املاح صفراوي مقاومند وبه همين دليل از اين مواد نيز علاوه بر رنگها در تهيه محيط‌هاي غني‌كننده استفاده مي‌كنند.

2-1-5-ساختار پادگني سالمونلا:
اسميت و ريگ43 در سال 1903 تفاوتهايي را كه در ماهيت و وضعيت پادگن‌هاي پيكري و تاژكي سالمونلا مشاهده كرده بودند گزارش نمودند ولي با اين وجود تا زمان وايت ـ كافمن كسي از اين مسأله استفاده نكرد. در حال حاضر در جدول وايت ـ‌ كافمن بيش از 2450سروتيپ وجود دارد كه تشخيص وشناسايي آنها براساس تعيين پادگن‌هاي پيكري (O) و تاژكي (H) به روش آگلوتيناسيون با آنتي سرم‌هاي اختصاصي مي‌باشد( زهرايي صالحي،1388).
حدود 67 نوع پادگن‌ پيكري يا O مختلف در سالمونلاها شناسايي شده كه آنها را با اعداد نشان مي‌دهد.پادگن‌هاي O در برابر حرارت و الكل مقاومند بطوريكه حرارت جوش را به مدت 5/2 ساعت تحمل مي‌كنند.
سالمونلاهاي متحرك‌ علاوه بر پادگن O داراي پادگن ديگري به نام پادگن H مي‌باشند كه مربوط به تاژك آنهاست ساختار اين آنتي‌ژن از پروتئين بوده و از ساختار واحدي به نام فلاژلين تشكيل شده است.پادگن‌هاي H نسبت به حرارت و الكل حساس بوده ولي در حضور 2/0 ـ 4/0 درصد فرمالدئيد به خوبي محافظت مي‌شوند. اگرچه درجه حرارت بالاي 60 درجه سانتي‌گراد باعث جدا شدن تاژك‌ها از باكتري مي‌شود ولي خاصيت ايمني‌زايي تاژك‌هاي جدا شده همچنان محفوظ باقي مي‌ماند.پادگن ديگر در سالمونلاها پادگن كپسولي يا پادگن K است در سالمونلاها 3 نوع پادگن K مشخص شده كه عبارتند از پادگن 5، پادگن حدت (Vi) و پادگن44 M پادگن 5 همانند پادگن O4 بوسيله الكل تخريب نمي‌گردد ولي نسبت به ساير پادگن‌هاي O به حرارت حساستر است. هر چند كه پادگن Vi و پادگن 5 هر دو به عنوان پادگن‌هاي K طبقه‌بندي مي‌شوند، ولي خواص بيوشيميايي و سرولوژيكي متفاوتي دارند (پووف وهمکاران،1997).
پادگن 5 از استيله شدن قند آبكوز ايجاد مي‌شود.
پادگن M لايه لعابي پلي ساكاريدي خارج يافته‌اي است كه حاوي اسيد كولانيك45 مي‌باشد. حرارت 100 درجه در عرض 5/2 ساعت باعث از بين رفتن پادگن M مي‌شود.پادگن Vi فقط در ساختار سالمونلا تيفي و پاراتيفي C و سالمونلا دوبلين وجود دارد(زهرايي صالحي،1388).پادگن ديگر در اكثر سروتيپ‌هاي سالمونلا پادگن‌هاي فيمبريه‌اي46 مي‌باشد كه اكثر سروتيپ‌هاي سالمونلا فيمبريه يا خار ايجاد مي‌كنند كه محمل پادگن‌هاي فيمبريه‌اي است. پادگن‌هاي فيمبريه‌اي همانند پادگن‌هاي تاژكي در حضور 1/0 ـ 2/0 درصد فرمالدئيد ثابت مي‌شوند. فيمبريه در درجه حرارت 100 درجه سانتي‌گراد به مدت 30 دقيقه از باكتري جدا مي‌شود ولي براي غيرفعال شدن آنها حرارت c ْ121 به مدت 30 دقيقه ضروري است (زهرايي صالحي،1388).

2-1-6- روشهاي طبقه‌بندي:
با استفاده از روش‌هاي سرولوژيكي و بيوشيميايي فهرست كاملي از گروه سالمونلا جهت طبقه‌بندي ارائه شده است. اولين جدول تشخيصي در 16 دسامبر 1929 توسط دانشمند انگليسي به نام وايت منتشر گرديد. در سال 1934 وايت به همراه كافمن دانماركي جدولي را منتشر كرد كه در مقايسه با جدول قبلي كاملتر و گسترده‌تر بود و در آن سالمونلا‌ها براساس پادگن O مشترك در گروه‌هاي خاصي قرار داده بودند (پووف وهمکاران،1997).با توجه به الگوي كافمن ـ وايت امروزه بيش از 2450 سروتيپ‌ شناسايي شده است (زهرايي صالحي،1388).اسامي كه به سالمونلاها اطلاق شده و مي‌شود از قانون و قاعده خاصي متابعت نمي‌كند. در ابتدا سالمونلاها را با اسامي كه نشانگر بيماري بود و يا حيواني كه باكتري براي اولين بار از آن جدا شده بود نامگذاري مي‌كردند. همانند اسامي كه در ابتدا براساس بيماريزايي و گونه حيواني در مورد سالمونلا تيفي، سالمونلا پاراتيفي A، سالمونلا كلراسويس، سالمونلا تيفي موريوم پادگن بكار گرفته شده و هنوز هم بكار مي رود. در حال حاضر سروتيپ هاي جديد سالمونلا را با اسامي شهر، ناحيه و يا كشوري كه آن سروتيپ براي اولين‌بار از آنجا جدا شده نامگذاري مي‌كنند كه در اين رابطه مي‌توان از سالمونلا لندن47، سالمونلا پاناما48، و سالمونلا حصارك49 كه اولين‌‌بار از ناحيه حصارك كرج جدا شده نام برد (زهرايي صالحي،1388).
در آخرين طبقه‌بندي كه از سال 1989 به بعد توسط لومينور، پوپف، ريوز50ارائه شده جنس سالمونلا به دو گونه سالمونلاانتريكا51، و سالمونلا بونگوري52، تقسيم شده است. گونه انتريكا خود داراي 6 تحت گونه است كه هر كدام از آنها سرووارهاي متعددي دارند (زهرايي صالحي،1388).
به دنبال تشخيص بيوشيميايي يكسري آزمايشات سرولوژيكي انجام مي‌گيرد كه پايه آن اگلوتيناسيون آنتي‌ژن‌هاي سطحي باكتري است. آنتي‌ژن‌هاي سطحي شامل (O) ليپوپلي ساكاريد (LPS) كه در سطح خارجي غشاء بيروني باكتري وجود دارد.
آنتي بادي‌ها اغلب بر عليه آنتي‌ژن O هستند. با اينكه هر كدام از اعضاي خانواده انتروباكترياسه داراي آنتي‌ژن O اختصاصي هستند اما گاهي يك باكتري ممكن است چندين آنتي‌ژن O داشته باشد. فلاژلا (H) آنتي‌ژن در ارتباط با تاژك‌هاي محيطي است كه اين آنتي‌ژن روي تاژك قرار گرفته است و توسط فرمالين از باكتري متحرك جدا مي‌شود. آنتي‌بادي‌هايي كه بر عليه اين آنتي‌ژن تشكيل مي‌شود از نوع IgG است و آگلوتيناسيون حاصل به صورت توده‌اي ابرمانند است. هدف از تست سرولوژي اطمينان از كامل بودن فرمول آنتي‌ژن در سالمونلاهاي جدا شده است. آنتي‌سرم‌هاي سوماتيك پلي‌والان به صورت تجاري در بازار وجود دارد كه شامل مخلوطي از آنتي‌بادي‌هاي ويژه براي آنتي‌ژن‌هاي سطحي مي‌باشد (لمينور،1981).

2-1-7-شرايط رشد سالمونلاها:
سالمونلاها قادرند در محيط‌هاي ساده آزمايشگاهي رشد نمايند و از تركيبات ساده كربن‌دار به عنوان منبع كربن و انرژي و از تعداد زيادي از تركيبات ازت به عنوان منبع نيتروژن استفاده كنند (زهرايي صالحي،1388).
اكثر سالمونلاها پروتوتروف بوده و در ميحط حداقل نمك53 با يك منبع كربن مناسب و يا محيط حداقل آمونيوم ـ گلوكز54 توانايي رشد دارند.
اكثر سويه‌هاي سالمونلاتيفي جهت رشد احتياج به اسيد آمينه تريپتوفان دارند.
رشد سالمونلاها در دامنه حرارتي 5 تا 47 درجه است ولي دماي اپتيمم 37 درجه است.بعضي از گونه‌هاي سالمونلا درجه حرارت‌هاي بالاتر از c ْ54 را نيز تحمل مي‌كنند و عده‌اي ديگر خواص سرما دوستي را بوسيله رشد كردن در c ْ4ـ2 از خود نشان دادند. دردرجه حرارت‌هاي پائين امكان رشد و بقاي سالمونلا بيشتر است. گزارش شده كه سالمونلاها نسبت به خشكي حساسند از اينرو انتشار آنها از طريق گرد و غبار و ذرات خشك كمتر از آب و مواد غذايي مرطوب است. بقاء سالمونلاها به طور نسبي به درجه حرارت محيط وابسته است(زهرايي صالحي،1388).به طوريكه در 55 درجه سانتي‌گراد در عرض يك ساعت و در 60 درجه در مدت 15 دقيقه نابود مي‌شوند.
پاستوريزاسيون شير باعث از بين رفتن سالمونلاها مي‌گردد. شير به مدت 3ـ2 ثانيه در 66 درجه سانتي‌گراد، تخم‌مرغ به مدت 10 دقيقه در 55 درجه سانتي‌گراد و گوشت به مدت 10ـ15 دقيقه در 65 درجه سانتي‌گراد معمولاً عاري از سالمونلاي زنده خواهند شد(زهرايي صالحي،1388).


پاسخ دهید