3-3-مراحل انجام کار………………………………………………………………………………………………………………………………………………………50
3-4-تهيه نمونه……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 51
3-5-استخراج RNA …………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 51
3-6-پارافين زدايي…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..51
3-7-خرد کردن و هضم بافت ………………………………………………………………………………………………………………………………………. 52
3-8-مراحل استخراج RNA از بلوک پارافينه ……………………………………………………………………………………………………………….52
3-9-آشکارسازي کمي RNA توسط دستگاه اسپکتروفتومتر…………………………………………………………………………………………53
3-10-سنتز cDNA…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………53
3-11- ژن کنترل داخلي…………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
3-12-پرايمر هاي ويژه Real TimePCR……………………………………………………………………………………………………………………….54
3-13- انجام واکنش Real timePCR ………………………………………………………………………………………………………………………….55
3-14-بررسي ميزان بيان ژن گيرنده استروژن آلفا در نمونه هاي سالم و سرطاني……………………………………………………….56
فصل چهارم: بحث و بررسي داده هاي تحقيق…………………………………………………………………………………………………………………57
4-1-نتايج جذب نوري RNA توسط دستگاه اسپکتروفتومتر…………………………………………………………………………………………58
4-2-منحني تکثير ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….58
4-3-نمودار منحني ذوب…………………………………………………………………………………………………………………………………………………59

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

4-4- نتايج ميزان بيان ژن ESR1…………………………………………………………………………………………………………………………………..60
4-5- آناليز و بررسي ارتباط داده ها………………………………………………………………………………………………………………………………..61
فصل پنجم: نتيجه گيري و پيشنهادات……………………………………………………………………………………………………………………………63
منابع و مآخذ…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….74
Abstract…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..86
فهرست جداول
جدولصفحه
جدول(3-1) مشخصات و مرحله بيماري در نمونه هاي مورد بررسي…………………………………………………………………………….51
جدول(3-2) توالي و مشخصات پرايمرهاي ويژه Real timePCR………………………………………………………………………………….54
جدول(3-3)مواد به کار رفته براي واکنش Real timePCR…………………………………………………………………………………………..55

جدول(3-4) برنامه حرارتي براي تکثير دو ژن GAPDH وESR1………………………………………………………………………………….55
جدول(4-1) نتايج بيان ژن افراد بيمار نسبت به افراد نرمال………………………………………………………………………………………….60
فهرست شکل ها
شکلصفحه
شکل (1-1)داکتال کارسينوماي درجا……………………………………………………………………………………………………………………………….4
شکل (1-2) لوبولار کارسينوماي درجا………………………………………………………………………………………………………………………………4
شکل (1-3) سرطان پستان تهاجمي…………………………………………………………………………………………………………………………………5
شکل (1-4)ژنتيک سرطان ارثي پستان………………………………………………………………………………………………………………………….12
شکل (1-5)مسير PI3K…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..17
شکل (1-6)دومين هاي مختلف گيرنده استروژن…………………………………………………………………………………………………………..23
شکل (1-7)مدل سلولي فعاليت استروژن……………………………………………………………………………………………………………………….24
شکل(1-8) عملکردGPR30 به عنوان يک پروتئين جديد متصلشونده به استروژن…………………………………………………….27
شکل (1-9)ايمونوهيستوشيمي……………………………………………………………………………………………………………………………………….32
شکل(1-10) RT PCR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………33
شکل(1-11) منحني ذوب……………………………………………………………………………………………………………………………………………….36
شکل(4-1) نمودار منحني تکثير ……………………………………………………………………………………………………………………………………58
شکل(4-2) نمودار منحني ذوب تک باند براي ژن ESR1……………………………………………………………………………………………..59
شکل(4-3)نمودار منحني ذوب تک باند براي ژن GAPDH…………………………………………………………………………………………59
شکل(4-4) نمودار نشان دهنده ميزان بيان ژن ESR1 در افراد بيمار در مقايسه با افراد نرمال……………………………………61
شکل(4-5)نمودار مقايسه بيان ژن ESR1در افراد مبتلا به سرطان و نرمال………………………………………………………………..61
شکل(4-6)نمودار مقايسه بيان ژن ESR1در افراد بيمار درstage هاي مختلف بيماري در مقايسه با افراد سالم………..62
چکيده
مقدمه: سرطان پستان شايع ترين نوع سرطان در زنان در سراسر دنيا و دومين علت مرگ و مير ناشي از سرطان است. اتصال استروژن به گيرنده استروژن آلفا باعث القا رشد تومور در اکثر سرطان هاي استروژن مثبت مي شود. هدف از اين مطالعه اندازه گيري بيان گيرنده استروژن آلفا در زنان مبتلا به سرطان پستان است.
روش كار: در اين مطالعه تعداد20 نمونه بافت پارافينه از زنان مبتلا به سرطان پستان و10 نمونه سالم جمع آوري شد. پس از پارافين زدايي، استخراج RNA با محلول RNX Plus انجام گرديد. cDNA با روش رونويسي معکوس به وسيله آنزيم MMULV سنتز شد. بيان ژن با روش Real timePCR نسبي سنجيده شد. ژن گليسر آلدهيد فسفات دهيدروژناز(GAPDH) نيز به عنوان کنترل داخلي استفاده گرديد.
يافته ها: گيرنده استروژن آلفا هم در بافت هاي سرطاني و هم سالم بيان شد اما بيان آن در بافت هاي سرطاني54/3برابر بيشتر از غيرسرطاني بود.نتايج نشان داد که با افزايش مرحله بيماري ميزان بيان گيرنده استروژن آلفا افزايش مي يابد((P<0.0001.تجزيه تحليل آماري با نرم افزار Grafpad prism 6صورت گرفت.
نتيجه گيري: با توجه به نتايج مي توان بيان نمود که ميزان بيان ژن گيرنده استروژن آلفا در نمونه هاي سرطاني به شدت افزايش مي يابد. بنابراين،اندازه گيري بيان ژن گيرنده استروژن آلفا مي تواند به عنوان يک عامل پيش آگهي دهنده ارزشمند براي تشخيص اوليه و مديريت درمان به حساب آيد.
واژه هاي كليدي: سرطان پستان،گيرنده استروژن آلفا،Real timePCR
فصل اول
کليات تحقيق
1-1-مقدمه
سرطان نوعي بيماري است که باعث مي شود سلول هاي بدن تغيير کرده و به صورت غير قابل کنترل رشد کنند.اکثر انواع سلول هاي سرطاني سرانجام تشکيل يک بر آمدگي يا توده اي مي دهند که تومور نام دارد و بعدا با بخشي از بدن که تومور از آن جا آغاز به شکل گرفتن کرده نامگذاري مي شوندet al.,2013-2014) Alteri).
سرطان پستان از بافت پستان شروع مي شود و بافت پستان از غدد توليد کننده شيرکه لوبول1 ناميده مي شود و مجاري2 که لوبول ها را به نوک پستان وصل مي کنند تشکيل شده است.باقي مانده پستان هم از چربي، بافت هاي لنفاوي و هم بند تشکيل شده است (Sharma et al.,2010).
سرطان پستان بطور عموم يا با روش هاي تشخيصي،قبل از اينکه نشانه ها توسعه يابند، يا بعد از اينکه علايم توسعه يافتند، وقتي که يک خانم برآمدگي (توده) را حس مي کند،تشخيص داده مي شود.اکثر توده هابا استفاده از ماموگرام ديده مي شوندو اکثر بر آمدگي ها ي پستان که خارج مي شوند خوش خيم هستند و خطري براي فرد ندارند.وقتي بر پايه آزمون هاي کلينيکي يا عکس از پستان به سرطان مشکوک مي شوند آناليز ميکروسکوپي بافت پستان براي تشخيص قطعي و تعيين ميزان گسترش (درجا يا تهاجمي بودن)ضروري است و الگوي بيماري را مشخص مي کند. بافت براي آناليز هاي ميکروسکوپي يا با سوزن يا با جراحي به دست مي آيد. نوع بيوپسي نيز بر پايه فاکتور هاي کلينيکي اختصاصي بيمار و وجود اسباب و وسايل بيوپسي مي باشد et al.,2013-2014) Alteri).
1-2-انواع سرطان پستان
1-2-1-درجا3
* داکتال کارسينوماي درجا 4 طيفي از تغييرات غير عادي پستان است که از سلول هاي مجاري پستان شروع مي شود(شکل1-1).DCISبه عنوان يک نوع غير تهاجمي سرطان پستان مورد توجه است چون که سلول هاي غير عادي بيش از لايه سلولي که از آن منشا مي گيرند رشد نمي کنند.اين نوع سرطان يک نوع عمومي اکثر انواع سرطان هاي پستان درجا است.DCIS ممکن است به سرطان تهاجمي تبديل بشود يا نشود.در حقيقت بعضي از اين تومور ها آنقدر آرام رشد مي کنند که حتي بدون درمان ، سلامتي فرد را تحت تاثير قرار نمي دهند.مطالعات نشان مي دهد که حدود يک سوم از مواردDCIS اگر درمان نشوند به سرطان تهاجمي تبديل مي شوندAllred.,2010) ).
شکل( 1-1)داکتال کارسينوماي درجا
(Cancer Research UK.,2014)
* لوبولار کارسينوماي درجا5 (که هم چنين به عنوانlabular neoplasia هم خوانده مي شود) سرطان يا حالت پيش سرطان واقعي نيست،اما شاخصي براي افزايش ريسک سرطان تهاجمي است(شکل1-2). LCIS شيوع کمتري نسبت به DCIS دارد(Allred.,2010)
شکل(1-2) لوبولار کارسينوماي درجا
(cancer research uk.,2014)
* ساير انواع سرطان هاي پستان هم نشانه هاي سرطان لوبولار و هم داکتال را دارند يا منشا نا مشخصي دارندAllred.,2010) ).
1-2- 2-تهاجمي
اکثر سرطان هاي پستان تهاجمي يا نفوذي6 هستند (شکل1-3). اين سرطان ها وقتي آغاز مي شوند ديواره هاي غدد يا مجاري را مي شکنند و به بافت هايي که پستان را احاطه کرده اند مي روند Allred.,2010) ).
شکل(1-3) سرطان پستان تهاجمي
( community connect to research)
1-3- مرحله
پيش آگهي سرطان پستان به شدت تحت تاثيرمرحله7 بيماري است و مشخص کننده اين است که آيا سرطان پس از تشخيص گسترش پيدا مي کند يا نه (.,2010 (Edge & Compton.
سيستم اصلي مشخص کننده stage در سرطان سيستم TNMاست. طبقه بندي تومورها بر پايه سيستم TNM،اطلاعات اندازه تومور و اينکه چقدر در بافت پستان گسترده شده (T)،ميزان و گسترش به غدد لنفاوي(N)، و وجود يا عدم وجود متاستاز(گسترش به ساير ارگان ها)(M) را به کار مي گيرد.بر پايه سيستم TNM ، stage هاي 0و1و2و3و4 را تعيين مي کنند. Stage 0 معمولا به صورت درجا است. Stage1 شروع سرطان تهاجمي است و stage4 پيشرفته ترين نوع بيماري است.سيستم TNM اغلب کاربرد کلينيکي دارد(.,2010 (Edge & Compton.
سرطان پستان فقط يک نوع بيماري نيست بلکه انواع مختلف آن بر حسب زير گونه هاي مولکولي متفاوت،فاکتور هاي خطر،رفتار هاي درماني و پاسخ به درمان وجود داردو انواع مختلف سرطان پستان از نظر مولکولي با به کار بردن پروفايل هاي بيان ژن تشخيص داده شده است(Perou et al.,2000).
LuminalA :حدود40%از سرطان هاي پستان luminalA هستند،که نوع عمومي سرطان هاي پستان است. اين نوع از سرطان ها ER+ و/يا PR+ وHER2- هستند،رشد کمي دارند،کم تر تهاجمي هستند(نسبت به بقيه انواع). به علت بيان گيرنده هورمون ها به هورمون درماني پاسخ مي دهند و پيش آگهي مطلوبي دارند. هر چند از نظر زنده ماندن مانند ساير انواع يا حتي کم تر از بقيه هستند Blows et al.,2010)).
LuminalB:حدود10تا 20 % سرطان هاي پستان luminalB هستند.مثل تومور هايluminalA اکثر تومورهاي luminalB ،ER+ و/يا PR+ هستند اما آنها با بيان HER2يا سرعت تکثير زياد(تعداد زيادي سلول هاي سرطاني به صورت فعال تکثير مي شوند) تشخيص داده مي شوندCheang et al.,2009)).
Basal like:حدود10 تا 20 %سرطان هاي پستان Basal like هستند و اکثر انواع سرطان هايBasal like،Triple negative ناميده مي شوند چون هم ER – , PR- هستند و هم HER2-. تومورهايBasal like در زنان آمريکايي و آفريقايي زياد است و آن ها داراي موتاسيونBRCA1 هم هستند.زناني کهBasal like هستند پيش آگهي ضعيف تر و عمر کم تري نسبت به ساير انواع سرطان ها دارند چون درمان هاي هدف دار8 ندارندPerou& Borresen-Dale.,2011)).
HER2 enriched:حدود10% از سرطان هاي پستانHER2 زياد توليد مي کنند (HER2 يک پروتئين محرک رشد است) و گيرنده هاي هورمون استروژن و پروژسترون را توليد نمي کنند. شبيه به نوع Basal like اين نوع سرطان به صورت تهاجمي رشد مي کند و گسترش مي يابد و در مقايسه با سرطان هاي ER+ ، افراد عمر کم تري دارند.هر چند درمان هاي هدف براي آن ها وجود داردBlows) et al.,2010).
1-4-علائم و نشانه ها
سرطان پستان معمولا وقتي تومور کوچک است علامتي ندارد و درمانش آسان است. وقتي سرطان پستان پيشرفت مي کند و تومور به حدي مي رسد که قابل لمس است،نشانه فيزيکي عمومي يک توده بدون درد است. گاهي سرطان پستان به غدد لنفاوي زير بغل گسترش مي يابد و حتي قبل از اين که تومور اصلي پستان قابل لمس باشد،ايجاد يک توده يا آماس مي کند(Alteria et al.,2013-2014)
نشانه هاي کمتر عمومي و علائم شامل:
* ترشح شفاف يا خوني از پستان
* پوسته‌ريزي در نوک پستان
* فرورفتن نوک پستان به داخل
* قرمزي و يا تورم پستان
* فرو رفتگي پوست پستان که در آن پوست، حالتي شبيه به پوست پرتقال پيدا مي‌کند
* وقوع تغيير شکل پستان که موجب متفاوت شدن آن با پستان ديگر شود
* تحريك پوست يا تغييراتي مثل چروك شدن ، فرورفتن، پوسته پوسته شدن
* گرمي ، قرمزي، و تورم همراه با جوش و دانه دانه شدن پوست پستان
* زخم در پوست پستان که بهبود پيدا نکندet al.,2013-2014) Alteri).
1-5-فاکتور هاي خطر سرطان پستان
1-5-1-سابقه فاميلي سرطان پستان
زنان (مانندمردان) با سابقه فاميلي سرطان پستان،به ويژه با سابقه در فاميل درجه يک (مادر،خواهر،دختر، پدر يا برادر)، احتمال بيشتري براي ابتلا دارند.اگر بيش از يک نفر از افراد فاميل درجه يک مبتلا باشند اين ريسک بيشتر است. ريسک سرطان پستان در زنان داراي يک فاميل درجه يک با سابقه بيماري،در مقايسه با زنان بدون سابقه فاميلي 8/1 برابر بيشتر ،در زنان با دو نسبت فاميلي مبتلا 3 برابر بيشترو براي زنان با سه يا بيشتر از سه فاميل مبتلا نزديک 4 برابر بيشتر است. هم چنين وقتي سن فاميل مبتلا کم تر باشد ريسک بالاتر مي رود.البته اکثر زنان با يک يا بيشتر سابقه فاميلي درجه يک هرگز مبتلا نمي شوند و اکثر زنان مبتلا هيچ گونه سابقه فا ميلي ندارند.سابقه فاميلي سرطان تخمدان با افزايش ريسک ابتلا به سرطان در زنان و مردان مرتبط است.زنان با يک سابقه فاميل سرطان پستان يا تخمدان در افراد فاميل نسبي بايد در مورد وجود استعداد ژنتيکي ابتلا به سرطان پستان با پزشک مشورت کنند et al.,2013-2014) Alteri).
1-5-2-وضعيت ژنتيکي
حدود 5 تا10% از موارد سرطان پستان،ناشي از موتاسيون هاي ارثي شامل BRCA1 و BRCA2 است. اين موتاسيون ها در کم تر از 1% از جمعيت عمومي وجود دارند. تخمين ريسک سرطان پستان در زنان با اين موتاسيون ها در سن 70 سالگي از 44% تا 78% در زنان با موتاسيونBRCA1واز 31 تا 56%در زنان با موتاسيون هايBRCA2 است. فقط حدود10-20% سرطان هاي پستان فاميلي به موتاسيون هايBRCA1وBRCA2 نسبت داده مي شود.ساير وضعيت هاي ارثي ،با ريسک کم تر سرطان شامل Li Fraumeni و سندرم cowden و تعدادي از موتاسيون هاي ژنتيک عمومي است.اين موتاسيون ها مي توانند از هرکدام از والدين و به پسر يا دختر به ارث برسندTurnbull &) Rahman.,2008). علاوه بر اين تغيير با ريسک کم در کد ژنتيکي ممکن است ريسک ابتلا به سرطان را زياد کند.دانشمندان معتقدند که اکثر سرطان هاي پستان ارثي ناشي از تاثير شيوه زندگي و تغييرات کم در کد ژنتيکي است که در يک خانواده مشترک استLichtenstein et al.,2000)). تست هاي مولکولي تجاري براي تشخيص موتاسيون هاي BRCA مثل تعدادي از سندرم هاي سرطان خانوادگي براي فرم هاي ارثي سرطان پستان وجود دارد،هرچند که تفسير و تصميم در مورد درمان هنوز قابل حل نيست و اين امکان وجود ندارد که پيش بيني کنيم که اگر کسي ژنتيک غير عادي خاصي را داشته باشد به سرطان مبتلا مي شود يا نه.به علاوه آزمايش ها براي همه ژن هايي که ريسک سرطان پستان دارند وجود نداردRobson et al.,2010)).
1-5-3-سابقه شخصي سرطان پستان
زنان با سابقه يک بار ابتلا به سرطان پستان ريسک ابتلاي مجدد به سرطان پستان دارند. اگر تشخيص در سن پايين تري باشد ريسک ابتلا بالاتر است.زناني که در سن پايين مبتلا مي شوند(سن<40)،5/4 برابربيشتر از بقيه ريسک ابتلاي مجدد دارند. وضعيت ژنتيکي،مثل موتاسيون درBRCA1 ،BRCA2 ، در احتمالا ابتلاي مجدد به سرطان پستان به ويژه در زناني که در سن پايين مبتلا شده اند دخالت دارند et al.,2013-2014) Alteri).
1-5-4- Lobular carcinoma in situ
اين وضعيت غير عادي نتيجه شکل گيري سلول هاي غير عادي در لوبول ها يا غدد توليد کننده شير در بافت پستان است. گرچه LCIS به ندرت به سرطان تهاجمي تبديل مي شود، زنان LCIS ،7 تا 12 برابر امکان تهاجمي شدن نسبت به زنان غيرLCIS دارند.LCIS معمولا در ماموگرام ظاهر نمي شود و معمولا با بيوپسي،به دليل ديگري آشکار مي شودو مثل مامو گرام غير عادي،LCISخالص بايد ازDCIS, وLCIS پلي مورفيک تشخيص داده شود و هر دو اين وضعيت ها بايد براي سرطان پستان مورد بررسي قرار گيرد و نيازمند درمان هستند et al.,2013-2014) Alteri).
1-5-5- Benign breast cancer
بعضي از انواع خوش خيم سرطان پستان مي توانند سرطاني شوند (ريسک سرطان پستان دارند). پزشکان اين وضعيت را با توجه به درجه خطر، به سه گروه عمومي طبقه بندي مي کنند:تغييراتي که همراه با تقسيم سلولي (غده) نباشد،تغييرات همراه با تقسيم سلولي (توده سلولي) و بدون تغيير و تبديل به حالت غير عادي ( سلول ها يا الگو هاي سلولي غير عادي) و وضعيت سوم وضعيتي است که همراه با تقسيم سلول و غير عادي شدن سلول ها است. وضعيتي که با تقسيم و تکثير همراه نيست باعث رشد بيش از حد سلول نمي شود و ريسک سرطاني شدن ندارد يا ريسک کمي دارد مثل فيبروز9 ،( که به تغييرات فيبرو سيستيک هم معروف است)،کيست هاي ساده و هايپر پلازي ملايم10. وضعيت تکثير بدون غير عادي شدن،ريسک کمي براي سرطاني شدن دارد.(5/1 تا 2 برابر بيشتر از کساني که چنين وضعيتي ندارند) و شامل فيبرو آدنوما و non-atypical ductal hyperplasia است. وضعيت تکثيري همراه با غير عادي شدن همراه با ريسک زياد سرطان پستان است.(4 تا 5 برابر بيشتر از ريسک متوسط) و شامل atypical ductal hyper plasia (ADH) وatypical lobular hyperplasia(ALH) است Hartmann et al .,2005)).
1-5-6-حجم پستان
حجم بالاي پستان يک فاکتور مهم و مرتبط با سرطان پستان است زنان با حجم پستان خيلي زياد4 تا 6 برابر در مقايسه با زنان با حجم پستان خيلي کم ريسک ابتلا به سرطان پستان دارندTamimi et) al.,2007).به علاوه مامو گرافي سرطان پستان براي بافت پستان حجيم،آسيب رسان است(Boyd et al.,2007).
1-5-7-ميزان هورمون هاي ا ندوژن
زنان يائسه با مقدار زياد هورمون هاي اندوژن11 مانند استروژن يا تستوسترون،دو برابر ريسک بيشتر براي ابتلا به سرطان در مقابل زنان با مقدار کم تر هورمون دارند ( Hankinson & Eliassen.,2007).
1-5-8-سيکل هاي قائدگي
زناني که به علت شروع زود قائدگي ( قبل از 12 سالگي) يا يا ئسگي ديرتر(بعد از 55 سالگي)، سيکل هاي قائدگي بيشتري دارند به علت قرار گرفتن بيشتر در معرض هورمون هاي باروري،ريسک بالاتري براي سرطان پستان دارند( Kaaks et al.,2005).
1-5-9-حاملگي
حاملگي در سنين کم تر (کم تر از 30 سالگي) و تعداد بيشتر حاملگي باعث کاهش ريسک ابتلا به سرطان در مورد سرطان هايي که وضعيت گيرنده هورمون ها در آن ها مثبت است مي گردد(Lambe et al.,1994).
1-5-10-شير دادن
اکثر مطالعات پيشنهاد مي کند که شير دادن ريسک کلي ابتلا به سرطان را در زنان کمي کاهش مي دهد. يک علت کاهش احتمال ابتلا با شير دادن ممکن است اين باشد که شير دادن مانع قائدگي مي شود و مدت زمان سيکل هاي قائدگي کم تر مي شود.احتمال ديگر تغييرات ساختاري است که شير دادن در بافت پستان ايجاد مي کند et al.,2013-2014) Alteri).
1-5-11-تراکم استخوان
تراکم استخوان در زنان يائسه با افزايش ريسک ابتلا به سرطان پستان مرتبط است و يک مارکر براي نشان دادن استروژن اضافي ودر واقع تجمع استروژن است(Kerlikowske et al.,2005).
1-5-12-فاکتور هاي وابسته به شيوه زندگي
به کار بردن هورمون هاي پس از قائدگي Beral et al.,2011))،چاقي و اضافه وزن( La Vecchia et al.,2011)، فعاليت بدني کمEliassen et al.,2010))،رژيم غذايي نامناسب و غني ازچربي( Vera-Ramirez et al.,2013)،مصرف الکلSingletary &Gapstur.,2001))،تنباکو(Gaudet et al.,2013)و قرص هاي ضدبارداريCalle et al.,1996)) از عواملي هستند که باعث افزايش احتمال ابتلا به سرطان پستان مي گردند.
1-5-13-ساير فاکتور هاي خطر
قرار گرفتن در معرض تشعشعاتPreston et al.,2009))،مصرف داروهايي مثل Diethylstilbestrol (براي جلوگيري از سقط جنين) Titus-Ernstoff et al.,2001))،آلودگي هاي محيطي مثل آفت کش ها Salehi et al., 2008)) وآلودگي هاي شغلي مثل قرارگرفتن در معرض درجات بالاي اتيلن اکسيد12 Steenland et al.,2003)) و شيفت هاي کاري شبانه Kamdar et al.,2013)) نيز با افزايش ريسک ابتلا به سرطان پستان مرتبط هستند.
1-6-فاکتورهاي ژنتيکي مرتبط با سرطان پستان
سرطان پستان يک بيماري به شدت ناهمگن است که در اثر تاثير متقابل عامل هاي خطر وراثتي و محيطي ايجاد مي شود و به تجمع پيشرونده تغييرات ژنتيک و اپي ژنتيک در سلول هاي سرطان پستان منجر مي شود(شکل1-4).اگر چه شواهد اپيدميولوژيک بر وجود عامل هاي خطر ويژه (مانندسن،چاقي،مصرف الکل،برخورد با استروژن در طول زندگي) تاکيد دارد، وجود سابقه خانوادگي سرطان پستان قوي ترين عامل خطر براي اين بيماري به شمار مي آيد.تقريبا20%همه سرطان هاي پستان را انواع خانوادگي تشکيل مي دهند و از نظر بيماري زايي، وابستگي خاصي به ژن مستعد کننده ويژه آن بيماري دارندAntoniou& Easton DF.,2006)).
با وجود اين که ژن هاي مسئول اغلب سرطان هاي خانوادگي پستان هنوز کشف نشده اند،حدود نيمي از سرطان هاي خانوادگي در اثر جهش هاي دودمان زايشي در ژن هاي سرکوبگر تومور13 رخ مي دهند که نقش اغلب آن ها حفظ درستي و تماميت ژنوم است(نوري دلويي وطبرستاني.،1389) اين ژن ها مشتمل بر موارد زير است:
* ژن هاي BRCA1 ،BRCA2
* TSGsهاي مرتبط با نشانگان هاي سرطان خانوادگي نادر مانند p53، PTENو ATM
* ژن هاي ديگر با خطر کم تا متوسط مانند CHEK2,BRIPI,PALB2,NBS1
* ژن هاي ترميم باز ناجور جفت (mismatch) مانند MSH2و MLH(نوري دلويي وطبرستاني.،1389)
شکل(1-4)ژنتيک سرطان ارثي پستان
(نوري دلويي وطبرستاني.،1389)
مطالعات هم بستگي ژنومي14 که گوناگوني هاي ژنتيکي (چند شکلي تک نوکلئوتيدي) را در وضعيت سرطان پستان خانوادگي بررسي مي کنند و مطالعات مورد شاهدي سرطان پستان،گوناگوني هاي ژنتيکي رايج و با نفوذ کم را در دست کم120ژن نامزد مشخص کرده اند. در ميان اين ژن هاي نامزد،موارد تاثير گذار اصلي که ارتباطي با خطر سرطان پستان دارند،ژن هاي دخيل در کنترل چرخه سلولي،متابوليسم هورمون هاي استروئيدي و مسيرهاي انتقال پيام سلولي هستند( Easton et al .,2007).
آلل هاي مستعد کننده رايجCASP8,TGFB1,FGFR2,TNC9,MAP3K1,LSP1 قوي ترين و با ثبات ترين شواهد ارتباط با سرطان پستان را دارند Easton et al .,2007))
1-6-1- ژن هاي BRCA1,BRCA2
ژن هاي BRCA1,BRCA2 به ترتيب برروي کروموزوم 17q12-21 و13q 12-13 قرار دارند و جزء ژن هاي مرسوم سرکوبگر تومور به شمار مي آيند،زيرا وجود يک نسخه از ژن معيوب به ارث رسيده براي مستعد شدن به سرطان کافي است،اگرچه از دست دادن آلل سالم براي ايجاد تومور لازم است.اين ژن پروتئين هاي بزرگ چند کاره اي را رمز دهي مي کنند که مکان هاي متعدد اتصال براي ارتباطات متقابل پروتئين-پروتئين دارند.ژن BRCA1سه قلمرو کارکردي عمده دارد و درچندين مجموعه پروتئيني شرکت دارد.هنوز مشخص نيست که کدام يک از کارکرد هاي پر شمارBRCA1,BRCA2 به نقش ويژه آن به عنوان يک ژن مستعد کننده سرطان پستان و تخمدان منجر مي شود.مطالعات اخير نقش BRCA1 در تغييرات ubiquitinرا در پاسخ به آسيب بهDNA و کنترل پويايي سانتروزوم مرتبط مي دانند. به نظر مي رسد که BRCA1 به شکل مجموعه اي با پروتئين هاي ديگر،در بسياري از فرآيند هاي سلولي شامل نوترکيبي هم ساخت،پاسخ آسيب به DNA،کنترل نقاط کنترلي چرخه سلولي،ubiquitination،تنظيم رونويسي،تغيير الگوي کروماتين،دو برابر شدن سانتروزوم و غير فعال شدن کروموزوم x موثر استTurnpenny & Ellard.,2011)).
فعاليت هايي که به BRCA2نسبت داده مي شود شامل همانند سازيDNAوترميم همساخت، رونويسي،تغيير الگوي کروماتين،دو برابر شدن سانتروزوم و سيتوکينز مي باشدGudmundsdottir &) Ashworth.,2006).
در مقايسه با سرطان هاي پراکنده پستان،سرطان هاي خانوادگي پستان ويژگي هاي خاصي دارند.مطالعات اخير با استفاده از دو رگه سازي ژنومي مقايسه اي15و تجزيه و تحليل ريز آرايه DNA 2 به همراه ايمونوهيستوشيمي و تکنيک FISH ويژگي هاي ژنتيکي و فنوتيپ ايمني ويژه اي را براي اين تومور ها نشان داده اند.آسيب شناسي و زيست شناسي مولکولي تومور هاي ناشي از جهش در BRCA1وBRCA2 با هم ديگر متفاوت است.تومور هاي مرتبط با جهش BRCA1 ويژگي هاي تهاجمي،شامل بروز زودرس،درجه بالاي تومور،گيرنده استروژن (ER) و گيرنده پروژسترون (PR) منفي و سرعت تکثير بالا را نشان مي دهندChappuis et al.,2000)).
فنوتيپBRCA1، با نشان گر هاي شبيه بازال يا سرطان پستان سه گانه منفي،بر اساس نيمرخ بيان ژن تعريف مي شود.تومور هاي مرتبط با BRCA1 با به دست آوردن يا حذف هاي کروموزومي ويژه،بيان بيش از حد انکوژن هاي ويژه (c-myc وc-myb)، پروتئين هاي چرخه سلولي (cycin E) و نشان گرهاي IHC براي فنوتيپ اپيتليال بازال (سيتوکراتين هاي بازال،گيرنده هاي عامل رشد اپيدرميFGFR، p-cadherin) مشخص مي شوند.ويژگي هاي مهم ديگر شامل از دست دادن tp53،تنظيم کاهشي p27و منفي بودنHER2 مي باشد.هر دو نوع سرطان پستان با جهش BRCA1و BRCA2،انکوژن TBX2را بيش از حد بيان مي کنند و معمولا درجه تومور آن ها بالاتر از سرطان هاي پراکنده پستان استChappuis et al.,2000)).
ژن هايBRCA1وBRCA2 وترميم DNA در شماري از سرطان هاي پستان ميزان بالايي از ناپايداري ژنومي از خود نشان مي دهند.اين ناپايداري ها با آنيوپلوئيدي،حذف شدن يا اضافه شدن هاي بزرگ کروموزومي،ناپايداري ريز ماهواره ها ،ناهنجاري هاي کروموزومي،تکثيرو سانتروزوم ها و تشکيل هسته هاي بسيار ريز مشخص مي شوند. اين تغييرات DNA ريشه در تغيير در مسيرهاي مولکولي تنظيم کننده تکثير سلولي ،تمايز ،آپوپتوز و ترميم DNA دارد (Farmer et al.,2005).
يافته هاي متقاعد کننده اي وجود دارد که نشان مي دهدBRCA1 بخش اساسي روند ترميم مي باشد.اختلال قابل توجه در نوترکيبي همتا و افزايش در فراواني اتصال انتهايي غير همساخت در سلول هاي بنيادي روياني موش فاقد brca1 مشاهده شده است.سلول هاي توموري فاقد brca1 موش و فاقد BRCA1 انساني به ميزان قابل توجهي عدم ثبات ژنومي،ناهنجاري هاي کروموزومي فاحش و تکثير سانتروزوم ها را نشان مي دهندYarden & Papa.,2006)).
هم پروتئين BRCA1 وهم BRCA2 جزئي از مجموعه پروتئيني آنمي فانکوني16 هستند.FA يک اختلال ارثي نادر است که با نارسايي مغز استخوان،اختلال در پايداري ژنومي و افزايش بروز سرطان مشخص مي شود.مجموعه پروتئيني FA مجري يک مسير ويژه ي ترميم از نوع همتا ضايعات DNA مي باشد که چنگال همانند سازي را مهار مي کند Mirchandani & D’Andrea.,2006))
1-7-اپي ژنتيک
سرطان هاي پراکنده پستان،افزون بر جهش هاي به ارث برده،از ساز و کار هاي اپي ژنتيک براي غير فعال کردن شمار زيادي از ژن هاي ترميم DNAاز جملهBRCA1,ATM,CHk2وp53 استفاده مي کنند. اپي ژنتيک بيانگر تغييراتي در کروماتين و DNA است که بيان ژني را تغيير مي دهد،اگر چه تغييرات در توالي DNA را شامل نمي شود.اين مساله بر خلاف سازوکار هاي ژنتيک مي باشد که در آن تغييرات در توالي DNA مي تواند موجب تغيير در بيان ژن شده و يا يک فرآورده پروتئيني تغيير يافته را رمز دهي کند.در سرطان ،سازوکار هاي عمده اپي ژنتيک که به بيان ژن غير عادي منجر مي شوند،شامل متيله شدن غير عادي جزاير CPGپروموتر،تغييرات کلي در متيله شدن DNA ژنومي و دگرگوني در تغييرات هيستوني (داستيله شدن و متيله شدن) مي باشند. اين اختلالات با مهار گر هاي مشتمل بر DNA متيل ترانسفراز و نيز HDAC قابل برگشت هستندBird.,2007)).
پيشنهاد شده است که متيله شدن پروموتر ممکن است به عنوان ضربه دوم در فرضيه دو ضربه اي نادسون از طريق غير فعال کردن آلل طبيعيTSGعمل کند.بيش متيله شدنBRCA1در جزاير CPG پروموتر در زيرگروهي از تومورهاي پستان پراکنده رخ مي دهد و ممکن است به عنوان نخستين ضربه با غير فعال کردن يک آللBRCA1 عمل کند. به دنبال آن از دست رفتن دومينBRCA1رخ مي دهد.به نظر مي رسد که متيله شدنBRCA1 در سرطان پراکنده پستان موجب فنوتيپ توموري مي شود،مشابه آن چه در تومور هاي حاملان جهشBRCA1رخ مي دهد. بر عکس،از دست دادن بيان ژن BRCA2از طريق متيله شدن غير عادي پروموتر در سرطان هاي پراکنده رخ نمي دهد( Esteller et al.,2001).
متيله شدن DNA برخي ژن ها ي خاص(مانندHIN-1RASSF1A,CYP26A1,KCNAB1,SNCA, TWIST,Cyclin D2) هم در ضايعات پيش بدخيم،مانند هيپرپلازي غير معمول و هم در سرطان پستان مشاهده شده است.اين يافته ها نشان مي دهند که تغييرات اپي ژنتيک معمولا در مراحل ابتدايي ايجاد تومور پستان رخ مي دهند و ممکن است به عنوان نشانگرهاي بالقوه براي تشخيص زودرس يا ارزيابي خطر به کار روند.تغيير در وضعيت متيله شدن برخي از ژن ها مشتمل بر? ER-,ER-?,cyclin D2,RAR-b,TWIST,RASSF1A,HIN-1 که اغلب و به نحو ويژه در سرطان پستان بيش متيله مي شوند و نيز ارتباط آن با تغييرات درc-reactive protein،سطح چربي خون،تراکم پستان مقابل و غلظت استروژن در دست بررسي استFackler et al.,2006)).
1-8-مسير هاي انتقال پيام سرطان پستان
مسير هاي گيرنده هاي عامل رشد :گيرنده هاي عامل رشد نقش اساسي هم در آغاز مسير هاي تکثير و هم بقاي سلولي درپستان وساير بافت هاي اپيتليال دارند.از نظر زيست شناسي سرطان پستان،EGFR ها و گيرنده هاي عامل رشد مشابه انسولين17بيشتر از همه مورد مطالعه قرار گرفته اند. اين گيرنده ها يک ناحيه اتصال به ليگاند برون سلولي،يک ناحيه ميان غشايي و يک قلمرو سيتوپلاسمي حاوي تيروزين کيناز دارند که مي تواند آبشار انتقال پيام رو به پايين18 را فعال کند.گيرنده هاي عامل رشد مي توانند از طريق سطح زياده از حد ليگاند،جهش هاي فعال کننده يا تکثير يا بيان بيش از حد ژن به شکل پيوسته فعال شوند که در نهايت منجر به فعاليت کينازي نا متناسب و فعال شدن پيامبر هاي ثانويه ي پيشبرنده ي رشد شودHellman & Rosenberg.,2005)).
شواهد متعدد ي نشان مي دهد که EGFR(HER1,Erbb1) و HER2(EGFR2 ياErbB2) گيرنده هايي هستند که به ويژه به زيست شناسي سرطان پستان مرتبط مي باشند و مي توانند هدف هاي بالقوه ي ديگري را براي درمان سرطان پستان فراهم آورند.در چندين مطالعه نشان داده شده است که تکثير يا بيان بيش از حد HER2 در سرطان پستان متاستاز شده،يک نشانگر مستقل پاسخ به پادتن مونو کلونالanti-HER2 ،trastuzumab(Herceptin) مي باشدHellman & Rosenberg.,2005)).
انتقال پيام با واسطه عامل رشد مشابه انسولين (IGF-1) و گيرنده هاي آن (IGF-IR) ،افزون بر فعال شدن مسيرEGFR،مي تواند به فسفوريله شدن و فعال شدن کيناز هاي انکوژنيک گوناگوني از جمله PI3-KوHER2منجر شود.IGF-IRواسطه اوليه پاسخ بهIGF است و در همه انواع سلول هاي اپيتليال بيان مي شود.مولکول هاي آداپتور مانند سوبستراي1گيرنده انسولين 19 واسطه انتقال پيام IGF-1 از طريق فسفوريله شدن تيروزين IGF-IR مي باشند.سطح بالاي IGF-1 به عنوان عامل خطر سرطان پستان مطرح استRenehan et al.,2006)).
در چندين کار آزمايي پيش باليني نشان داده شده است که IGF-IR هدف موثري به نظر مي آيد واز اين رو،کارآزمايي هاي باليني که مهارگر هاي IGF-IR را بررسي مي کنند،در دست انجام است.دو نوع گوناگون پادتن بر عليه IGF-IR در کار آزمايي مرحله 2 در حال ارزيابي هستند.پادتن هاي مونوکلونال بر عليه IGF-IR مي توانند internalization گيرنده را به جريان انداخته و به نحو موثري سطح IGF-IRرا در سطح سلول،دست خوش تنظيم کاهشي کنند. بنابر اين پادتن هاي عليه IGF-IR موجب مهار انتقال پيام هم IGF و هم انسولين در سلول هاي سرطاني مي شوند.افزون بر اين،مهار گرهاي ضد IGF-IR با مولکول کوچک توليد شده اند که برخي از آن ها،گرچه بسيار اختصاصي نيستند،اما در مطالعات پيش باليني بسيار موثر بوده اند.در واقع،مهارIGF-IR وEGFR مي تواند درمان ترکيبي مفيدي باشدRenehan et al.,2006)).
1-8-1- مسير PI3K
مسير فسفاتيديل اينوزيتول3-کيناز((PI3-Kدر پاسخ به عامل هاي متعددي فعال مي شود وبه افزايش رشدوتکثير سلولي سرطان پستان منجر مي شود(شکل1-5).جهش هاي فعال کننده در ژني که زير واحد کاتاليتيک p110-a PI3K (PI3CKA) را رمز دهي ميکند،ممکن است عامل موثري در پيشرفت تومور پستان باشد.جهش هاي فعال کننده در خانواده ژنيAKT نادر هستند((Bachman et al.,2004
شکل(1-5)مسيرPI3K
cassimeris et al.,2011))
PTEN،قلمروکاتاليتيکPI3-Kرا دفسفوريله و در نتيجه غير فعال مي کند و در بسياري از سرطان هاي پستان يا جهش پيدا مي کند يا (براي نمونه از طريق متيله شدن) کم بيان مي شود.فعال شدن مسيرPI3-Kبه نوبه خود،موجب فعال شدن وابسته به3-فسفو اينوزيتايد20 چندين کيناز شناخته شده مي شودکه از آن جمله مي توان بهAKT1,AKT2وAKT3با واسطه کيناز اشاره نمود. به نظر مي رسدAKT فعال آنتي آپوپتوتيک باشد.اگر چه در عين حال يک نقش تهاجمي هم در تشکيل تومور ايفاميکند (Cassimeris et al.,2011)
1-9-رگزايي
فرآيند رگزايي تومور حائز اهميت بسيار بالا و هدف مهمي براي درمان بسياري از سرطان ها به شمار مي آيد. افزون بر سلول هاي آندوتليال،سلول هاي سرطاني پستان هم گيرنده VEGFR را بيان مي کنند.VEGFR ها، مانند EGFRها ،گيرنده هاي تيروزين کيناز هستند. VEGF-Aهم به (F1t-1) VEGFR1وهم به (KDR/F1K1) VEGFR2 متصل مي شود. به نظرمي رسد VEGFR2واسطه تقريبا همه پاسخ هاي سلولي شناخته شده به VEGFها باشد،در صورتي که کارکردVEGFR1کمتر مشخص شده است.Bevacizumabيک پادتن مونوکلونال انساني عليه VEGF-a است ودر مطالعات پيش باليني نشان داده شده است که موجب کاهش رگزايي مي شود. مهارگرهاي فعاليت تيروزين کينازي VEGFRبا اندازه مولکولي کوچک،مانند sunitinib در بسياري از سرطان ها موثر نشان داده شده اند و ممکن است تاثير بخشي باليني در سرطان پستان هم داشته باشندTabernero.,2007)).
1-10-عامل هاي پيش آگهي مولکولي
سرطان پستان يک بيماري نا همگن است و سال هاست که اين اعتقاد وجود دارد که تومور هايي که ويژگي هاي زيست شناختي متفاوتي دارند،نتايج باليني و پاسخ هاي درماني متفاوتي دارند.در حال حاضر،پيش آگهي و انتخاب درمان در سرطان پستان بر اساس تعيين وضعيت گيرنده هاي هورمون رشددرتوموراست. تکثير سلولي ويژه مهم سرطان است و پروتئين هاي هسته اي غير هيستوني ki67،نشانگر مناسبي براي اين فرآيند است.رنگ آميزيki67 مي تواند هم به عنوان يک نشانگر سودمندي درمان،از طريق اندازه گيري هاي متعدد بر روي نمونه هاي بافتي پي در پي در حين درمان،به کار رودDowsett & Dunbier.,2008)).
از سال 2007 به بعد چندين نيمرخ بيان ژن”پيش آگهي بد” با استفاده از ويژگي هاي فنوتيپي گوناگون زيست شناسي سرطان مهاجم مانند پاسخ به زخم و پاسخ به کمبود اکسيژن،ايجاد شده است. تجزيه و تحليل هاي گذشته نگر نشان مي دهند که اين الگو هاي ژني،اطلاعات پيش آگهي مستقلي،بهتر و بيشتر از آنچه که با استفاده از نشانگر هاي آسيب شناختي مرسوم مانند اندازه تومور،وضعيت غده لنفاوي،درجه،تهاجم لنفي – عروقي و وضعيت هورمون – گيرنده به دست مي آيد ،در اختيار قرار مي دهد.تلاش در جهت ترکيب سه الگوي بيان ژن،دقت پيش آگهي را بهبود نبخشيد Fan et al.,2006)).
آزمون نسبت بيان ژن سرطان پستان21يک الگوي بيان دو ژني ساده است که نسبت ژن هايHOXB6,IL17BR را که توسط استروژن تنظيم مي شوند،اندازه گيري مي کند.اين نسبت به نحو قابل توجهي با ميزان کم بقا بدون وجود بيماري،در مبتلايان به سرطان پستان غده لنفاوي منفي،گيرنده استروژن مثبت و درمان با تاموکسيفن،مرتبط مي باشد.اخيرا اضافه شدن پنج ژن مربوط به چرخه سلولي به اين آزمون،به منظور در بر گرفتن درجه مولکولي،اجراي آن را بهبود بخشيده استDowsett & Dunbier.,2008)).
پنج ژن اضافه شده جزئي از شاخص درجه ژنومي22 97 ژني پيچيده تري هستند که به منظور رده بندي تومور ها به دو گروه با خطر کم و زياد ايجاد شده است.ژن هاي استفاده شده در الگوي درجه ژنومي بيش تر در تنظيم چرخه سلولي و تکثير نقش دارند.هنگامي که از اين الگو در جمعيت بيماران با گيرنده استروژن مثبت استفاده شد،هم در بيماران درمان شده با تاموکسيفن و هم در موارد بدون درمان سيستميک،گروه هايي با دو نتيجه باليني از نظر آماري متفاوت شناسايي شد.با وجود اين که شاخص درجه ژنومي تقريبا به طور اختصاصي از ژن هاي تکثيري تشکيل شده است،نمره هاي شاخص درجه ژنومي با رده بندي هاي شناخته شده لومينال A و B و با گروه هاي خطر شناخته شده توسط آزمون هاي Mammaprint ,oncotype DXوالگوي 76 ژنيRotterdamمرتبط مي باشد. به دليل آن که ژن هاي مرتبط با تکثير در همه اين آزمون هاي بيان ژن به وفور وجود دارد،اين ارتباط ممکن است بيانگر اهميت تکثير به عنوان يک عامل پيش آگهي در سرطان پستان باشدDowsett &) Dunbier.,2008).
1-11-تنظيم هورموني
ميزان مواجهه با استروژن،عامل خطر پذيرفته شده اي براي ايجاد سرطان پستان ER مثبت مي باشد.استروژن يک هورمون استروئيدي است که اثر تکثيرکنندگي شديدي برروي اپيتليوم پستان طبيعي انسان از طريق فعال کردنER? دارد که يک گيرنده ي هورموني هسته اي معمولي دارد. ER?در70درصد موارد سرطان پستان بيش از حد بيان مي شود.به نظر مي رسد تکثيرER?يک سازوکار عمده باشد،اگرچه سازوکار هاي ديگري هم وجود دارد.امروزهER? هنوز يکي از موثرترين اهداف براي درمان و پيشگيري سرطان پستان محسوب مي شود و آنتي استروژن ها جزئي از رژيم هاي درماني توصيه شده براي همه توده هاي بيان کننده ER?هستند.استروژن اثر خود را از طريق سازوکار هاي ژنومي و غير ژنومي اعمال مي کندHellman & Rosenberg.,2005)).
بافت پستان انسان مراحل متعددي از تکثير،تمايز و پسرفت23 را طي ميکند که توسط تغيير در سطح هورمون در گردش خون و طي دوره هاي قائدگي و کهولت ايجاد مي شود،هورمون هاي تخمداني و به خصوص استروژن،نقش کليدي در سبب شناسي و زيست شناسي سرطان پستان ايفا مي کنندEigeliene et al.,2006)).
استروژن نقش بسيار مهمي در ايجاد و پيشرفت سرطان پستان به عهده دارد،اين تاثير در سه تا از قطعي ترين عوامل خطر سرطان پستان که با تغييرات ترشح استروژن مرتبط اند، منعکس مي شود.اين سه عامل خطر عبارتند از: سن اولين قاعدگي(منارک)،سن زمان يائسگي و سن در زمان اولين حاملگي با دوره کامل. سرطان هاي پستان که از نظر گيرنده هاي استروژني مثبت هستند(ER+)،سرعت رشد کمتري دارند،به خوبي تمايز پيدا ميکنندوطول عمر بدون بيماري طولاني تري را براي بيماررقم مي زنند) Shao& Brown.,2004).


پاسخ دهید