1-8-4 ) مکانيسم هاي مقاومت در برابر عوامل ضد قارچي :32
1-9 ) مکانيسم اثر فلوکونازول :33
1-9-1 ) فرمول شيميايي فلوکونازول :33

1-9-2 ) مکانيسم مقاومت کانديدا عليه فلوکونازول :34
1-9-3 ) نحوه استفاده از داروهاي آزول :34

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

فصل سوم : مواد و روش ها41
3-1) اسامي تعدادي از مواد، وسايل و دستگاه هاي مورد استفاده:42
3-1-1) مواد و محيط کشت هاي مورد ازمايش:42
3-1-2) وسايل و دستگاه هاي مورد استفاده:42
3-2) مواد و روش ها:45
3-2-1) جمع آوري نمونه ها:45
3-2-2) بررسي مستقيم ميکروسکوپي:45
3-2-3)کشت روي محيط:46
تهيه محيط کشت سابورو دکستروز آگار:46
3-2-4) تشخيص آزمايشگاهي گونه هاي کانديدا :47
3-2-4-1) بررسي پرگنه در محيط کروم آگارکانديدا:47
3-2-4-2) آزمايش ايجاد لوله زايا :48
3-2-4-3)مورفولوژي و بررسي کلاميدوکونيدي بر روي کورن ميل آگار( CMT80 ) :48
3-2-4-4)بررسي ايجاد کلاميدوکونيدي در محيط کازئين اگار:49
3-2-4-5) رشد در دماي 45 درجه سانتي گراد :49
3-2-4-6) واکنش زنجيره اي پليمراز PCR و RAPD :50
3-2-5) تهيه سوسپانسيون سلول مخمري کانديدا آلبيکنس:54
3-2-6 ) روش ميکروديلوسين :54
3-2-7 ) موارد کنترل مثبت و کنترل منفي آزمايشات :55
3-2-8 ) انتقال ميکروپليت ها به گرم خانه ( گرم خانه گذاري ) :55
3-2-9 ) کشت مجدد محتويات هر يک از حفرات ميکروپليت روي محيط سابورو دکستروز آگار حاوي کلرامفنيکل ( SC ) :56
فصل چهارم: نتايج58
4-1 ) نتايج حاصل از شناسايي کانديدا آلبيکنس توسط روش PCR-RFLP :59
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري71
5-1 ) ارزيابي تعيين گونه هاي کانديدا در مبتلايان به ولوواژينيت عود کنندکانديدايي:72
5-2 ) ارزيابي عملکرد ضد قارچي داروي فلوکونازول روي قارچ کانديدا آلبيکنس :74
منابع :79
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 1- برخي از گونه هاي بيماريزاي کانديدا و نام مرحله جنسي آنها16
جدول2- مشخصات مورفولوژيک گونه هاي بيماريزاي پر اهميت کانديدا16
جدول- 3 مروري بر انواع عفونتهاي کانديدايي و عوامل مستعدکننده آنها17
جدول 4-2 : تعداد و درصد عدم رشد قارچ ( کشندگي ) کانديدا آلبيکنس61
جدول 4-1 : نتايج فعاليت هاي مهار رشد ( MIC90 ) و قارچ کشي ( MFC ) داروي فلوکونازول روي سويه هاي قارچ کانديدا آلبيکنس60
جدول 4-3 : تعداد و درصد مهار رشد قارچ کانديدا آلبيکنس61
جدول 4-4 : ميانگين و انحراف معيار غلظت کشندگي قارچ کانديدا آلبيکنس62
جدول 4-5 : ميانگين و انحراف معيار مهار کنندگي قارچ کانديدا آلبيکنس62
جدول 4-6 : ميانگين و انحراف معيار سن در مبتلايان به ولوواژينيت کانديديايي62
جدول 4-7 : مقايسه گروه هاي سني در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي63
جدول 4-8 : مقايسه تعداد دفعات زايمان در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي64
جدول 4-9 : بررسي وضعيت بارداري در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي64
جدول 4-10 : بررسي شدت علائم بيماري در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي65
جدول 4-11 : بررسي عوارض جسمي و روحي ناشي از ولوواژينيت کانديدايي در مبتلايان66
جدول 4-12 : بررسي سابقه استفاده از داروي فلوکونازول در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي67
جدول 4-13 : بررسي سابقه استفاده از داروهاي ضد قارچي ( غير از فلوکونازول ) در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي68
جدول 4-14 : بررسي سابقه ابتلا به بيماري هاي خاص در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي68
جدول 4-15 : بررسي سابقه استفاده از دارو در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي69
جدول 4-16 : بررسي روش درماني در موارد قبلي بيماري در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي70
جدول 4-17 : بررسي وضعيت سيستم ايمني در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي70
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4-1 : مقايسه درصدي گروه هاي سني در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي63
نمودار 4-2 : مقايسه درصدي شدت علائم بيماري در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي66
نمودار 4-3 : مقايسه درصدي عوارض جسمي و روحي ناشي از ولوواژينيت کانديدايي در مبتلايان67
نمودار 4-5 : مقايسه درصدي وضعيت سيستم ايمني در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي70
نمودار 4-4 : مقايسه درصدي سابقه استفاده از دارو در مبتلايان به ولوواژينيت کانديدايي69
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل3 -1: گرم خانه43
شکل3 -2 : اتوکلاو44
شکل3 – 3 : هود لامينار44
شکل 3- 4 : ميکروسکوپ نوري44
شکل3 – 5 : کشت کانديداروي محيط سابرو دکستروز آگار46
شکل3- 6 : محيط سابرودکستروز آگار ( قبل از کشت قارچ )46
شکل 3- 7 : وجود كانديدا آلبيكنس در محيط كروم آگار48
شکل3- 8 : مرحله ورتکس در استخراج DNA51
شکل3- 9 : مراحل استخراج DNA52
شکل3 – 12 : پر کردن حفره هاي ميکروپليت توسط سمپلر و سر سمپلر در روش ميکروديلوسين55
شکل 3- 13 : رشد کانديدا آلبيکنس روي محيط SC بعد از برداشت از حفرات ميکروپليت57
شکل3- 11 : روش ميکرودايلوشن در پليت 96 خانه اي57
شکل3- 14 : نحوه قرائت نتايج در کشت مجدد از خانه هاي تلقيح شده57
شکل 4-1 : الکتروفورز DNA استخراج شده از گونه هاي کانديدا59
شکل 4-2 : تشخيص مولکولي گونه هاي کانديداآلبيکنس59
چکيده
زمينه و هدف: ميزان بروز ولوواژينيت کانديديايي عود کننده توسط گونه هاي کانديدا روند رو به افزايشي را نشان مي دهد. بر اساس مطالعات، بعضي از گونه هاي کانديدا نسبت به داروهاي ضد قارچي مثل فلوکونازول مقاومت نشان مي دهند. بنابراين با جداسازي و شناسايي گونه هاي کانديداي مسبب فرم عود کننده ولوواژينال و تعيين حساسيت آنها به داروي فلوکونازول مي توان الگوي مناسبي از بيماران و مقاومت دارويي آنرا در منطقه جغرافيايي مورد پژوهش گزارش کرد.
روش کار: جدايه ي مخمري مورد آزمايش مستقيم، کشت و آزمايش هاي تکميلي براي شناسايي گونه هاي مختلف کانديدا از قبيل روش هاي مولکولي PCR RFLP ) ( و غير مولکولي (سابرو دکستروز آگار، کروم آگار، تست لوله زايا) قرار گرفتند. سپس فلوکونازول بر روي هر کدام از نمونه ها به روش ميکروديلوسيون براث آزمايش شد و حداقل غلظت مهارکنندگي و حداقل غلظت قارچ کشي داروها اندازه گيري و حساسيت آنها تعيين شد.
يافته ها: در بررسي حداقل غلظت مهارکنندگي ايزوله هاي جدا شده مشخص شد تأثير داروي ضد قارچي فلوکونازول عليه سويه هاي کانديدا آلبيکنس حاصل از بيماران مبتلا به ولوواژينيت کانديدايي عودکننده حساس وابسته به دوز مي باشد.
نتيجه گيري : با استفاده از يافته هاي حاصل از اين تحقيق مي توان گفت در ولوواژينيت کانديدايي حاد يا مزمن شايد فلوکونازول تأثير روي سويه هاي کانديدا آلبيکنس داشته باشد ولي در ولوواژينيت کانديدايي عودکننده يا بايد از فلوکونازول با دوز بالا استفاده شود يا از داروهاي ديگر ضد قارچي استفاده شود.
واژگان کليدي: ولوواژينيت کانديدايي عودکننده، فلوکونازول، کانديدا آلبيکنس.

فصل اول
مقدمه
عفونت هاي فرصت طلب ناشي از مخمرها در دهه هاي اخير اهميت زيادي يافته است(30).علت اين مسئله روند رو به تزايد اين عفونت ها از لحاظ بروز و شيوع در جامعه و در بين عفونت هاي بيمارستاني است .
كانديديازيس طيفي از بيماري هاي قارچي فرصت طلب است كه در افراد مستعد به شكل عفونت هاي سطحي ساده تا عفونت هاي سيستميك ايجاد مي شود(45).
امروزه كانديديازيس از بيماري هاي مهم عفوني مطرح در جهان است و در حدود 25 تا 50 درصد عفونت هاي بيمارستاني در بخش مراقبت هاي ويژه و 8 تا 15 درصد كل عفونت هاي بيمارستاني را كانديديازيس تشكيل مي دهد(69).
ولوواژينيت کانديديايي دومين عفونت شايع دستگاه تناسلي زنان پس از واژينوز ناشي از باکتري هاي بي هوازي است. حدود 75 درصد از خانم ها حداقل يک بار در طول عمر خود دچار عفونت کانديديايي واژن مي شوند. اين بيماري ممكن است به صورت حاد، مزمن و يا عود كننده تظاهر نمايد. اغلب زنان به فرم حاد بيماري مبتلا مي گردند (49.50). ميزان بروز ولوواژينيت کانديديايي عود کننده 1(RVVC) توسط گونه هاي کانديدا روند رو به افزايشي را نشان مي دهد. (RVVC) حالتي است که در آن علايم بيماري در طول يک سال حداقل 3 بار و يا بيشتر تکرار گردد(34.35). اين علايم ممکن است شديد و همراه با تحمل رنج و ناراحتي قابل ملاحظه اي براي آنان باشد(51.49).
علايم محلي ولواژينال شامل ترشحات زرد شيري، غليظ و غشا كاذب خاكستري در سطح مخاط واژن همراه است(19). در اين بيماري سوزش ادرار بسيار شايع بوده و ترشحات واژن افزايش مي يابد، اما شايع ترين علامت خارش ناحيه واژن است كه اغلب در طول دوره قبل از قاعدگي شديدتر مي شود(100).
شايع ترين مخمرهاي جدا شده از واژن شامل کانديدا آلبيکنس (?? تا ?? درصد) کانديدا گلابراتا (? تا10 درصد) وکانديدا تروپيکاليس (? تا ? درصد) مي‌باشد. ساير گونه‌هاي مخمري که از شيوع کمتري برخوردارند عبارتند از کانديدا دابلينينسيس، کانديدا کروزه‌يي، کانديدا فاماتا (?/? تا ? درصد) مي باشند.
عامل بيماري قارچي فرصت طلب از جنس كانديدا مي باشد كه به صورت همزيست در دستگاه گوارش، مخاطات، پوست انسان و ساير حيوانات بوده و حتي در محيط نيز يافته مي شود. اين عامل در شرايطي كه مقاومت ميزبان به صورت موضعي يا سيستميك به صورت اوليه و يا ثانويه در اثر عوامل مستعد كننده بيماري كاهش يابد، قادر به ايجاد بيماري در هر ناحيه از بدن خواهد بود. وجود محدوديت هايي همچون تعداد كم داروهاي ضد قارچي، سمي بودن آنها براي سلول هاي بدن يا كاهش حساسيت يك سري از گونه هاي كانديدا به اين داروها، همواره به عنوان معضلات اساسي در درمان بيماري مطرح بوده اند(38).
از دلايل مهم ايجاد بيماري واژينيت کانديدايي عودکننده، حذف ناقص کانديدا از واژن پس از درمان ضدقارچي است، هر چند ممکن است علايم باليني و التهابات بيمار کم شود، اما ارگانيسم به تعداد کم در واژن ميماند و منجر به ناقل شدن بيمار مي گردد(76).
بر اساس مطالعات، بعضي از گونه هاي کانديدا نسبت به داروهاي ضد قارچي مثل فلوکونازول مقاومت نشان مي دهند. بنابراين با جداسازي و شناسايي گونه هاي کانديداي مسبب فرم عود کننده ولوواژينال و تعيين حساسيت آنها به داروي فلوکونازول مي توان الگوي مناسبي از بيماران و مقاومت دارويي آنرا در منطقه جغرافيايي مورد پژوهش گزارش کرد.
اهداف اين تحقيق:
1. تعيين گونه هاي کانديدايي مقاوم به داروي فلوکونازول در درمان بيماران مبتلايان به ولوواژينيت کانديديايي عود کننده ( RVVC ) شهرستان گناباد مي باشد.
2. تعيين حداقل غلظت مهار کنندگي ( MIC ) داروي فلوکونازول روي نمونه هاي کانديدايي مبتلايان به ولوواژينيت عود کننده.
3. تعيين حداقل غلظت قارچ کشي ( MFC ) داروي فلوکونازول روي نمونه هاي کانديدايي مبتلايان به ولوواژينيت عود کننده.
فصل دوم
مروري بر تحقيقات انجام شده
1-1 ) قارچ شناسي پزشکي :
قارچ شناسي2 به معناي مطالعه قارچ ها است. بيش از 50000 گونه قارچ وجود دارد، که اکثر آنها براي انواع انسان سودمند هستند. اين قارچ ها در طبيعت يافت مي شوند و وجود آنها براي تجزيه و بازيافت مواد آلي ضروري است (36).
برخي از قارچ ها با ايفاي نقش در توليد مواد غذايي و نوشابه هاي الکلي، تا حدود زيادي کيفيت زندگي ما را بهبود مي بخشند. عده ديگري از قارچ ها با تهيه متابوليسم هاي ثانويه مفيد و فعال از نظر زيستي، نظير آنتي بيوتيک ها (مثل پني سيلين3) و داروهاي سرکوب کننده ايمني ( مثل سيکلوسپورين4) ، خدمت عظيمي به علم پزشکي کرده اند(9).
همه قارچ ها ارگانيسم هايي يوکاريوک هستند و هر سلول قارچي حداقل يک هسته و غشاي هسته اي ، شبکه آندوپلاسمي ، ميتوکندري و دستگاه ترشحي دارد. اکثر قارچ ها هوازي اجباري يا اختياري هستند. آنها کموتروفيک5 هستند، آنزيم هايي ترشح مي کنند که انواع بسياري از مواد آلي را به مواد مغذي محلول تجزيه مي کنند و سپس اين مواد مغذي به صورت غير فعال جذب سلول قارچ شده و يا به روش انتقال فعال وارد آن مي گردند. عفونت قارچي را مايکوزها6 مي نامند(9).
اکثر قارچ هاي بيماري زا برونزاد هستند و زيستگاه طبيعي آنها در آب، خاک و بقاياي مواد آلي است. مايکوزهايي که ميزان بروز آنها از همه بيشتر است، يعني کانديدياز7 و درماتوفيتوزها8 ، به وسيله قارچ هايي ايجاد مي شوند که بخشي از فلور ميکروبي طبيعي انسان هستند و يا براي بقاء در بدن انسان به عنوان ميزبان، تا حدود زيادي تطابق پيدا کرده اند. به منظور سهولت ميکوزها را مي توان با عناوين سطحي ، جلدي ، سيستميک و فرصت طلب9 رده بندي کرد(10).
درمان اکثر ميکوزها مشکل است. خوشبختانه ، هم اکنون توجه و علاقه فرآيندها به قارچ هاي مهم از نظر پزشکي و همچنين نسبت به جستجو براي يافتن عوامل بيماري زايي قارچ ها و اهداف درماني بالقوه آنها جلب شده است(10).
1-2 ) عفونت هاي قارچي :
عفونت هاي قارچي10 اگرچه در گذشته شيوع كمتري نسبت به عفونت هاي باكتريايي11 و ويروسي12 داشته اند، ولي در چند دهه اخير مسؤول افزايش چشمگيري در ميزان بروز بيماري بوده اند. در بررسي انجام شده مابين سا لهاي 1979 الي 2000 در آمريكا بروز عفونت هاي قارچي 207 درصد افزايش داشته است(35).
در يك بررسي ديگر انجام شده در آمريكا مابين سال هاي 1980 تا 1997 نشان داده شده كه ميزان مرگ و ميرناشي از عفونت هاي قارچي افزايش يافته و به عنوان يكي از متداول ترين علل مرگ و مير از رتبه دهم به رتبه هفتم ارتقاء يافته است (36).
عوامل مستعدكننده اي مانند استفاده وسيع و طولاني مدت از آنتي بيوتيك ها، كورتون ها13، داروهاي سركوب گر ايمني14 و بيماري هاي زمينه ايي همچون ديابت، ايذر و بدخيمي ها و … سبب شده اند كه بيماري هاي قارچي خصوصاً كانديديازيس نسبت به گذشته رو به افزايش باشند. در طي يك تحقيق گونه هاي كانديدا به عنوان چهارمين عامل از عوامل مرگ و مير ناشي از عفونت هاي گردش خون به حساب آمده و 35 درصد از موارد عفونت هاي خوني منجر به مرگ را، شامل شده اند . (36.37).
عامل بيماري قارچي فرصت طلب از جنس كانديدا مي باشد كه به صورت همزيست در دستگاه گوارش، مخاطات، پوست انسان و ساير حيوانات بوده و حتي در محيط نيز يافته مي شود. اين عامل در شرايطي كه مقاومت ميزبان به صورت موضعي يا سيستميك به صورت اوليه و يا ثانويه در اثر عوامل مستعد كننده بيماري كاهش يابد، قادر به ايجاد بيماري در هر ناحيه از بدن خواهد بود. وجود محدوديت هايي همچون تعداد كم داروهاي ضد قارچي، سمي بودن آنها براي سلول هاي بدن يا كاهش حساسيت يك سري از گونه هاي كانديدا به اين داروها، همواره به عنوان معضلات اساسي در درمان بيماري مطرح بوده اند(38).
عفونتهاي قارچي واژن15 در 95-85 درصد موارد در اثر کانديداآلبيکنس16 بوجود مي آيند . کانديدا آلبيکنس را ميتوان از واژن 20 درصد زنان بدون علامت جدا کرد(74.75).
عفونت هاي فرصت طلب ناشي از مخمرها در دهه هاي اخير اهميت زيادي يافته است(39).علت اين مسئله روند رو به تزايد اين عفونت ها از لحاظ بروز و شيوع در جامعه و در بين عفونت هاي بيمارستاني است . بيماري هاي ناتوان كننده اي مثل ايدز، ديابت مليتوس و بدخيمي ها و نيز افزايش كاربرد كاتترهاي وريدي، پيوند اعضاء، داروهاي ضد سرطان، آنتي بيوتيك هاي وسيع الطيف و درمان با كورتيكو استروئيدها17 از جمله زمينه هاي مساعد كننده ابتلا به عفونت هاي مخمري است (38).
اهميت شناسائي عوامل قارچي متنوع اين عفونت ها را در چند جهت مي توان خلاصه نمود : 1) برخي از اشكال باليني خاص با برخي از عوامل خاص مرتبط هستند. به عنوان مثال بيماران مبتلا به لوسمي بيشتر به كانديدا آلبيكنس مبتلا مي شوند در صورتي كه بيماران واجد تومورهاي سخت در معرض خطر بيشتري براي ابتلا به عفونت هاي ناشي از كانديدا گلابراتا18 هستند. 2) ويرولانس هر كدام از گونه هاي مخمري با يكديگر متفاوت بوده و شرط لازم درك پاتوژنز عفونت ها،تعيين هويت عامل عليتي بيماري است .3) گونه هاي مختلف نسبت به داروهاي ضد قارچي حساسيت متفاوتي دارند. به عنوان مثال حساسيت كانديدا تروپيكاليس19 كمتر از كانديدا گلابراتا نسبت به فلوكونازول 32-4 برابر كانديدا آلبيكنس است. همچنين كانديدا لوزيتانيا20 داراي مقاومت نسبي ذاتي به آمفوتريسين 21B است، پيدا كردن منابع عفونت و درك راه هاي انتقال بيماري به ويژه در طغيان هاي بيمارستاني مستلزم شناسائي گونه ها است. (40.41).
1-3 ) مخمرها (Yeasts) :
مخمرها22 قسمت عمده اي از فلور نرمال پوست و سطوح مخاطي را شامل مي شوند و هنگامي كه ميزبان به هر علتي دچار نقص ايمني شود، موجب عفونت هاي قارچي فرصت طلب سطحي، جلدي، مخاطي و يا سيستميك مي شوند. عفونت هاي مخمري از جمله كانديديازيس از مهم ترين و شايع ترين عفونت هاي قارچي فرصت طلب هستند كه به صورت حاد، تحت حاد و مزمن در پوست، ناخن، سطوح مخاطي واژن، برونش، ريه و دستگاه گوارش ايجاد مي شوند گاهي نيز منتشر شده و كليه، كبد، ريه و قلب را گرفتار مي سازند(11). واكنش ميزبان در برابر بيماري از يك التهاب مختصر تا بروز ضايعات چركي و گرانولوماتوز23 در تغيير است. در چند دهه اخير افزايش چشمگيري در عفونت هاي ايجاد شده توسط اين ارگانيسم ها اتفاق افتاده است و افزايش بروز عفونت هاي فرصت طلب مخاطي و سيستميك توسط مخمرها با افزايش جمعيت بيماران با سيستم ايمني ناكارآمد و هم چنين پيشرفت در علم پزشكي و استفاده از روش هاي درماني جديد در ارتباط بوده است(42.43).
1-3-1 ) روشهاي شناسايي مخمرها :
شناسايي مخمرها براي درك روابط اپيدميولوژيك عفونت – محيط و شناخت مخازن، منابع و منشأ بيماري ضروري است. روش هاي متعددي از گذشته تا حال براي تعيين هويت مخمرها و در رأس آنها كانديداها به كار رفته است. اين روش ها را كلاً مي توان به دو گروه فنوتيپيك24 و ژنوتيپيك25 تقسيم نمود. از جمله روشهاي گروه اول عبارت است از: مرفولوژي مخمرها در محيط عصاره مالت آگار26، روش هاي جذب و تخمير قندها ) اجراي اين روش ها بسيار متنوع بوده از متدهاي قديمي كشت در لوله هاي حاوي محيط مايع) روش ويكرهام( تا استفاده از ديسك ها ي قندي)اگزانوگرافي27( ، استفاده از كيتهاي تجارتي مثل API و بالاخره روش هاي جديد اتومات مثل سيستم Vitek در تغيير است، روشهاي سرولوژي ) مثل سيستم تجارتي (Candida Check، روش كشت روي محيط هاي رنگ زا مثل (CHROMagar Candida) و روش هاي ديگر(107.108).
روش هاي ژنوتيپي نيز متنوع بوده، از جمله مي توان به استفاده از پرايمرهاي اختصاصي در PCR و
multiplex- PCR ، استفاده از پروب هاي اختصاصي هرگونه، ،PCR-RFLP ، تعيين توالي نواحي ژني خاص و real-time PCR اشاره نمود (109).
1-4 ) عفونت فرصت طلب :
اکثر بيماراني که به عفونت هاي فرصت طلب مبتلا مي شوند به بيماري هاي زمينه اي وخيم و اختلال دفاع هاي ميزبان دچار هستند. عفونت هاي فرصت طلب در افراد واجد کفايت ايمني هم مشاهده مي شوند. در حين عفونت ، اکثر بيماران پاسخ هاي ايمني سلولي و همورال قابل ملاحظه اي نسبت به آنتي ژن هاي قارچي نشان مي دهند (74).
عفونت کانديدا مي تواند سطحي يا تهاجمي باشد. عفونت سطحي اغلب در پوست يا غشاي مخاطي تأثير مي گذارد و مي تواند با موفقيت با داروهاي ضد قارچي موضعي درمان شوند. با اين حال عفونت هاي قارچي تهاجمي اغلب تهديد کننده زندگي هستند، که احتمالاً به علت روش هاي تشخيصي ناکارآمد و نامناسب اوليه در درمان داروهاي ضد قارچ است(34).
عوامل خطر براي کانديديازيس تهاجمي شامل : عمل جراحي ( به خصوص جراحي شکم ) ، سوختگي ، اقامت طولاني مدت در بخش مراقبت هاي ويژه ، آنتي بيوتيک هاي وسيع الطيف و سرکوب کننده هاي سيستم ايمني هستند(34).
پيشرفت در عملکردهاي پزشکي به عنوان مثال : شيمي درماني ، پيوند عضو ، دياليز ، تغذيه تزريقي و کاتاتر وريدي مرکزي همچنين به تهاجم و کلونيزاسيون قارچ ها کمک مي کنند. (34).
1-5 ) کانديدا و کانديديازيس :
-5-1 ) تاريخچه :
در حدود 200 سال زمان نياز بود تا عامل بيماري تراش28، اولين شکل بيماري کانديديازيس که توصيف شده است، بدرستي تشخيص داده شود. اولين اشاره به لفظ تراش در سال 1665 ميلادي توسط Pepys بوده است، هرچند منبع اصلي و نسخه اصلي اولين توصيف از اين بيماري مربوط به بقراط است که در چهارصد سال قبل از ميلاد مسيح در دو بيمار آنرا توصيف کرده است(77). در سال 1846 ميلادي Berg در يک مطالعه علمي بر روي بيماري، ارتباط بيماري را با قارچها نشان داد. در سال 1839 ميلادي Langenbeck عامل بيماري را براي اولين بار جدا کرد و در سال 1847 ميلادي، Robin آنرا تحت عنوان Oidium albicans طبقه بندي کرد. اين اولين بار بود که لفظ آلبيکنس(به معناي سفيد کردن يا سفيد شدن) درباره عامل تراش بکار برده شد. در سال 1888 Hansen عامل بيماري در گروه مونيليا قرار داد. در سال 1923 Berkhout بدليل آنکه اين موجود زنده به وضوح با گونه هاي مونيليا تفاوت داشت، نام ژنريک کانديدا (بر گرفته از يک لغت لاتين به معناي لباس سفيدي که کانديدا هاي مجلس سنا در روم باستان بر تن ميکردند)، را براي آن پيشنهاد داد. در سال 1931 Benham بدنبال ملاک هاي تشخيص اين قارچ، خصوصيات تشخيصي آنرا تشريح کرد. و در سال 1954 ميلادي در هشتمين کنگره گياه شناسي رسماً کانديدا آلبيکنس به عنوان عامل بيماري پذيرفته شد. در سالهاي 1950 تا 1990مطالعات اغازين انجام شده خصوصا در زمينه تاکسونومي،بيوشيمي و ميکروسکوپي بسط يافت(112).
جنبه هاي بيولوژي مولکولي در طي دهه 80 ميلادي با کشف ديپلوئيد بودن ژنوم کانديدا آلبيکنس و وجود هتروزيگوسيتي طبيعي در بين جدايه ها انتشار يافت(113).روشهاي ترانسفورماسيون، جداسازي ژنها، حذف ژنها، تايپينگ سوشها و آناليز کروموزومها گسترش يافت. تعيين توالي اسيد هاي نوکلئيک در ژنوم کانديدا آلبيکنس کامل شده است و مدارک جديدي دال بر وجود مرحله جنسي در آن بدست آمده است(114).
کانديديازيس بعنوان يک معضل باليني ، اصولا در بيماراني که سيستم ايمني شان29 به مخاطره افتاده است همچنان باقي مانده است. اين اتفاق ناگهاني نبوده است – در حاليکه توجه به کانديدا آلبيکنس به عنوان مهمترين گونه بيماريزا بيشتر بوده است – اکنون ساير گونه ها از قبيل کانديدا گلابراتا ، کانديدا کروزئي30 و کانديدا دابلي نينسيس31 نيز از نظر باليني اهميت پيدا کرده باشند. تا حدي اين مسئله مربوط به پيشرفت هاي علمي در اين زمينه است. استفاده از فلوکونازول که به عنوان يک داروي جايگزين براي آمفوتريسين B توجهات را به خود جلب کرد، منجر به ظهور برخي از گونه ها به عنوان گونه بيماريزا شد که مقاومت ذاتي يا اکتسابي به اين دارو داشتند(115).
1-5-2 ) بيولوژي :
جنس کانديدا شامل حدود 200 گونه متفاوت است ، اما تنها تعداد کمي از گونه ها پاتوژن هاي فرصت طلب انسان هستند و سبب عفونت ميزبان ناتوان يا داراي نقص ايمني مي شوند(115).در واقع 65% از گونه هاي کانديدا توان رشد در 37 سانتي گراد را ندارند؛ خصوصياتي که در واقع براي بيماريزايي يک عامل عفوني لازم است(116).
کانديدا يک مخمر تخم مرغي کوچک با ديواره نازک و قطرm 4,6 % است و جوانه توليد مي کند. ارگانسيم هاي اين جنس درون بافت به 3 فرم هستند. بلاستوپور32 ، سودوهيف33 و هيف34. کانديدا به آساني بر روي محيط کشت ساده رشد مي کند. ليز سانترفيوژني به جدا کردن آن از خون کمک مي کند. گونه ها توسط آزمايش بيو شيميايي ( در حال حاضر توسط وسايل اتوماتيک )يا بر روي آگارهاي خاص شناسايي مي شوند(116).
از نکات قابل توجه اين است که تعداد عوامل بيماريزاي کانديدايي رو به افزايش است که تغيير در طبقه بندي و نيز کشف گونه هاي جديد نيز در آن دخيل بوده است. بطور مثال کانديدا گلابراتا در ابتدا در خانواده کانديدا قرار نداشت و کانديدا دابلي نينسيس از گونه آلبيکنس جدا شده است. برخي گونه نيز بالقوه براي بيماران درگير از نظر سيستم ايمني بيماريزا هستند. گونه هاي کانديدا اغلب براي انسان غير بيماريزا اند و بصورت ساپروفيت در محيط وجود دارند، اما گونه هاي بيماريزا معمولا از بيماران و يا ميزبانهاي انساني و حيواني گزارش شده اند، بنابراين اعتقاد بر اين است کانديديازيس منشأ دروني35 دارد(84).
جنس کانديدا متشکل از اجرام 36قارچي هتروژني است که به شکل مخمري رشد مي کنند و اغلب گونه ها در کنار فرم مخمري اشکال فيلامنتي مثل هايف کاذب نيز ايجاد مي کنند( جدول -1). اما در
اين بين کانديدا آلبيکنس و کانديدا دابلينينسيس ايجاد ميسليومهاي حقيقي مي کنند و به آنها پلي مورفيک مي گويند. در آزمايشگاهها از روي خصوصيات ميکروسکوپي و عوامل موثر بر رشد براي تشخيص استفاده مي کنند(جدول-2).
بطور معمول از آزمايش ايجاد لوله زايا در محيط سرم، و بررسي ايجاد کلاميدوکونيدي در محيط کورن ميل آگار، رشد در محيط کروم آگار کانديدا و الگوي جذب کربوهيدراتها براي تشخيص گونه ها استفاده مي شود.
1-5-3 ) تاکسونومي کانديدا :
در گذشته گونه هاي جنس کانديدا بدليل فقدان مرحله جنسي (تلئومورف) در دسته قارچهاي ناقص37 قرار مي گرفتند، از سوي ديگر مرحله جنسي برخي گونه هاي مختلف بيماريزا و غير بيماريزا بتدريج توصيف شد اما با اين وجود همچنان از نظر تاکسونوميک در دسته قارچهاي ناقص قرار مي گيرند و با نام آنامورف (مرحله غير جنسي) ناميده مي شوند. اغلب گونه هاي کانديدا از نظر جنسي جزء آسکوميستها طبقه بندي مي شوند و بررسي توالي ها DNA مراحل جنسي و غير جنسي ارتباط با آسکوميستها را ثابت مي کند. همچنين برخي از خصوصيات درباره گونه هاي کانديدا وجود دارد که نشان مي دهد به آسکوميستها تعلق دارند. براي مثال، اوره آز منفي، فاقد کپسول، تخمير کننده، اينوزيتول منفي هستند؛ در ديواره سلولي بتا گلوکان مي سازند و توانايي توليد نشاسته و پيگمان کاروتنوئيد را بر خلاف بازيديوميستها ندارند. مرحله جنسي(کونژوگاسيون) در محيط هاي مثل V8 اگار، محيط عصاره مخمر مالت آگار و محيط McClary’s استات در گونه هاي هتروتاليک38 قابل القاء است(115).
1-5-4 ) ژنتيک و بيولوژي مولکولي کانديدا :
مطالعه در سطح ژنوم و DNA کانديدا آلبيکنس به دليل اين حقيقت که اين مخمر بطور ثابت داراي ژنوم ديپلوئيد و بدون مرحله جنسي است، دچار اشکال است زيرا ايجاد يک موتانت نيازمند تخريب با حذف ژن يا ژنهاي مشابه و همسان در هر دو آلل در ژنوم است، که باعث مشکلات و پيچيدگي در تمام مطالعات بيان ژن و تنظيم ژني در اين موجود زنده شده است. عليرغم اين معظلات اطلاعات کاملي درباره بيولوژي اين مخمر بدست آمده است و در سايتهاي مختلف مربوطه موجود است. صدها توالي DNA در Gene bank database ثبت شده است. پيچيدگي هاي زيادي در ژنوم کانديدا وجود دارد؛ کدون سه تايي CUG که بطور نرمال يک رزيدوي لوسين را کد مي کند در گونه هاي کانديدا سرين را کد مي کند. اين اختلاف در اثر تغييرات در ساختارهاي حلقوي tRNA سرين در کانديدا مي باشد و ممکن است در خاصيت ترموتولرانسي گونه هاي کانديدا دخيل باشد. همچنين کدون CTG به لوسين ترجمه مي شود در کانديدا آلبيکنس به سرين ترجمه مي شود. با وجود آنکه مرحله جنسي در کانديدا آلبيکنس شناخته نشده است اما ژنهاي همولوگ با ساکارومايسس سرويسيه که در توليد عوامل جفت گيري39 و ساير عملکرد هاي مرتبط با ميوز دخيل اند يافت شده اند. نقش اين ژنها در کانديدا آلبيکنس شناخته نشده است. البته محتمل بنظر نمي رسد که کانديدا آلبيکنس داراي مرحله جنسي پنهان يا شناخته نشده اي باشد زيرا ژنوم کانديدا آلبيکنس بسياري جهش هاي ژني کشنده منفرد است که با يک الل ديپلوئيد عملکردي و اصلي به توازن رسيده اند. در واقع يک سازماندهي مجدد ژني40 جايگرين مرحله جنسي حقيقي در کانديدا آلبيکنس شده است (117.118).
کانديدا آلبيکنس داراي هشت کروموزموم دوتايي است که از يک تا 7 نامگذاري شده اند، بعلاوه يک کروموزم R که از نظر اندازه بسيار متغير است. تعداد کروموزوم در برخي از گونه هاي ديگر نيز شناسايي شده است، در کانديدا گلابراتا و کانديدا پاراپسيلوزيس41 14، در کانديدا گيلرموندي42 و کانديدا کروزئي 8، کانديدا کفير43 18 و در کانديدا تروپيکاليس 12 مي باشد. کانديدا تروپيکاليس نيز همانند کانديدا آلبيکنس ژنوم ديپلوئيد دارد ولي کانديدا گلابراتا هاپلوئيد است. اندازه کروموزموم ها از Mb 0.5 تا 4.5 است و در تمام گونه ها بجز گلابراتا اندازه آنها از ساکارومايسس بزرگتر است(119).
1-5-5 ) ريخت شناسي و شناسايي کانديدا :
گونه هاي کانديدا در محيط کشت يا بافت به صورت سلول هاي مخمري بيضي شکل ( به اندازه 6-3 ميکرومتر ) رشد مي کنند. همچنين هنگامي که جوانه هاي آنها به رشد خود ادامه مي دهند ولي از يکديگر جدا نمي شوند، ريسه هاي کاذب تشکيل مي شوند، و زنجيره هايي از سلول هاي دراز به وجود مي آورند که در محل تيغه هاي بين سلولي، فشرده يا منقبض شده اند. (119).
1-5-6 ) ايمني در مقابل کانديدا :
اساس مقاومت در مقابل کانديدا پيچيده است و به طور کامل شناخته نشده است. پاسخ هاي ايمني با واسطه سلولي، به ويژه سلول هاي CD در کنترل و مهار کانديدا جلدي – مخاطي اهميت فراواني دارند و احتمالاً نوتروفيل ها44 براي مقاومت در برابر کانديدياز سيستميک ضروري و حياتي هستند (115).
1-5-7 ) كانديديازيس :
كانديديازيس طيفي از بيماري هاي قارچي فرصت طلب است كه در افراد مستعد به شكل عفونت هاي سطحي ساده تا عفونت هاي سيستميك ايجاد مي شود(26). اين عفونت به صورت حاد، تحت حاد و مزمن در پوست، ناخن، مخاط دهان و واژن، برنش، ريه و دستگاه گوارش ظاهر مي گردد و در حالت سيستميك، ساير اعضاي بدن از قبيل كليه، كبد، قلب و ساير قسمت هاي ديگر بدن را آلوده مي نمايد (68). اين ارگانيسم همه جا در طبيعت حضور دارند و بر روي اشياء بي جان ، درون غذاها و بر روي حيوانات يافت مي شوند و همزيست هاي نرمال انسان هستند (68). گستره اين بيماري ها از عفونت هاي سطحي و مخاطي ساده تا عفونت هاي سيستميك خطرناك و حتي عفونت هاي منتشره كشنده ، كشيده شده است .عوامل عليتي بيماري ، قارچ هاي مخمري متعلق به جنس كانديدا مي باشند.
اگرچه موارد کانديدياز از زمان هاي گذشته در بيماران ناتوان توصيف شده است، اما ظهور گونه هاي کانديدا به عنوان پاتوژن هاي شايع انساني مربوط به زمان، معرف رويکردهاي درماني مدرن است که مکانيسم هاي دفاعي طبيعي ميزبان را سرکوب مي کنند. از ميان اين پيشرفت هاي نسبتاً اخير، مهمترين آنها مصرف مواد آنتي باکتريال است که فلور ميکروبي نرمال انسان را تغيير مي دهد (45).
امروزه كانديديازيس از بيماري هاي مهم عفوني مطرح در جهان است و در حدود 25 تا 50 درصد عفونت هاي بيمارستاني در بخش مراقبت هاي ويژه و 8 تا 15 درصد كل عفونت هاي بيمارستاني را كانديديازيس تشكيل مي دهد (69).
در حقيقت سيستم نظارت عفونت هاي بيمارستاني ملي ( NNISS ) گزارش داده اند گونه هاي کانديدا به عنوان پاتوژن هاي جريان خون بيمارستاني هستند. تخمين زده اند که ميزان مرگ و مير بالاتر از 45% است که احتمالاً به دليل تشخيص ناکارآمد و درمان ضد قارچي نامناسب اوليه است (34).
اغلب افراد) نه همه ( اين قارچ را در زمان تولد در طي عبور از كانال زايمان كسب مي كنند. قارچ در بدن فقط بصورت كلني و در تعادل با ساير ميكروارگانيسمها زندگي ميكند و بصورت ساپروفيت شايع روي سطوح مخاطي بويژه دهان، دستگاه گوارشي و واژن ديده مي شود، اما عوامل مختلف مي توانند اين تعادل را بهم زده و منجر به بروز بيماري علامت دار پيشرونده فعال گردند (70.71).
عوامل متعددي نظير چسبندگي، مداومت تماس، ديمورفيسم45، تشكيل جرم تيوب46، حساسيت تماسي، تغييرشكل فنوتيپي، تداخل با سيستم ميزبان، سينرژيسم با باكتري ها و توليد هيدرولازها47 يا ساير متابوليت ها به عنوان عوامل ويرولانس كانديدا آلبيكنس اشاره شده اند (72).
اگرچه كانديدا آلبيكنس شايع ترين عامل كانديدايي مسئول عفونت در اشكال باليني مختلف كانديديازيس بوده و هست، ولي گونه هاي ديگر متعلق به جنس كانديدا از جمله كانديدا
تروپيكاليس، كانديدا گلابراتا، كانديدا پاراپسيلوزيس، كانديدا كروزه اي، كانديدا گيليرموندي و غيره نيز كم و بيش از بيماران جدا مي شوند. اهميت گونه هاي غير آلبيكنس در سال هاي اخير به واسطه بروز مقاومت نسبي در بعضي از اين گونه ها نظير كانديدا تروپيكاليس و كانديدا گلابراتا نسبت به برخي از داروهاي ضد قارچي زيادتر شده است (39.44.46).
با معرفي داروهاي ضد قارچي، علل عفونت هاي کانديدا از غلبه بودن تقريباً کامل کانديدا آلبيکنس گفته مي شود. در حال حاضر گونه هاي غير کانديدا آلبيکنس تقريباً نيمي از همه موارد کانديدمي و کانديدياز منتشر شده از طريق هماتوژن را تشکيل مي دهند، تشخيص اين تغيير از نظر باليني حائز اهميت است چرا که گونه هاي مختلف از نظر حساسيت به گونه هاي ضد قارچ جديدتر با هم تفاوت دارند (32).
شواهدي وجود دارد که کانديدا پاراپسيلوزيس مقاوم به عوامل ضد قارچي امکان انتقال عفونت هاي بيمارستاني را در محيط هاي بيمارستاني از طريق دستان پرسنل بيمارستان، وسايل داخل رگي و مايعات، افزايش مي دهد(30.21).اين موضوع باعث افزايش وفور نسبي اين گونه ها مي گردد، ضمن اين كه تعيين فراواني گونه هاي مسئول عفونت ها از نقطه نظر اپيدميولوژيك و كنترل عفونت ها به خصوص در عفونت هاي بيمارستاني ناشي از كانديداها حائز اهميت است.
گونه هاي کانديدا به عنوان چهارمين عامل عفونت زاي بيمارستاني در آمريکا گزارش شده اند (28.29).در کشورهاي توسعه يافته، که تجهيزات درماني به طور رايج مورد استفاده قرار مي گيرند گونه هاي کانديدا در حال حاضر از شايع ترين پاتوژن هاي بيمارستاني هستند (46). بيماري کانديديازيس سيستميک در حال حاضر يکي از بيماري هايي است که داراي ميزان مرگ و مير بالايي بوده (48). و هم چنين باعث اقامت طولاني افراد مبتلا در بيمارستان ها و تحميل هزينه هاي سنگين درمان مي شود.
جدول 1- برخي از گونه هاي بيماريزاي کانديدا و نام مرحله جنسي آنها
Sexual(teleomorph)Species(anamorph) Not describedC. albicans Not describedC. tropicalis Not describedC. glabrata Not describedC. parapsilosis Issatchenkia orientalisC. krusei Pichia guilliermondii(ohmerii)C. guilliermondii Kluyveomyces marxianusC. kefyr Not describedC. viswanathiiClavisopora lusitaniaeC. lusitaniae Not describedC. dubliniensis Debaryomyces hanseniiC. famata Not describedC. inconspicua Pichia jadaniiC. utilisPichia norvegensis C. norvegensis Yarrowia lipolytica C. lipolytica
جدول2- مشخصات مورفولوژيک گونه هاي بيماريزاي پر اهميت کانديدا
CHROM agar Pseudohyphae 1Germ tubeChlamydospore Species Green/blue+++C. albicans Dark blue/ blue grey, with dark halo +–/+C. tropicalis 2 White, pink-purple4_–C. glabrata White, pale pink+–C. parapsilosis Pale pink, purple, rough+/—C. krusei 3 Dark green+++C. dubliniensis Pale pink, purplePrimitive–C. guilliermondiiPink, grayish purpleVariable–C. lusitaniae Pink, purple+–C. kefyr White pinkPrimitive–C. inconspicuaWhite, light pink, purplePrimitive–C. famata
1- بررسي وجود هايف بر روي محيط کورن ميل اگار حاوي توئين 80
2- در شرايط خاص توانايي ايچاد کلاميدوکونيدي دارد.
3- کانديدا کروزئي و کانديدا اينکانس پيکوآ از نظر فنوتيپي به هم بسيار نزديک هستند.
4- کانديدا گلابراتا در صورتيکه در محيط سنتتيک low-ammonium dextrose agar رشد داده شود ايجاد سودوهايف مي کند.
در بين گونه هاي مخمري با اهميت از نظر پزشکي، کانديدا آلبيکنس قادر است در اشکال و فرم هاي مختلف رشد يابد. کانديدا آلبيکنس قادر است اشکال مخمري گرد، بلاستوکونيدي48 جوانه دار، ميسليوم کاذب49 کوتاه و يا بلند و ميسليوم حقيقي ايجاد مي کند بطوريکه اصطلاح پلئومورفيسم را درباره آن بکار مي برند. همچنين کانديدا آلبيکنس تحت شرايط رشد مناسب قادر به ايجاد کلاميدوکونيدي50 است (120).


پاسخ دهید