3-6- نمره دهي باندهاي مشاهده شده روي آگارز نشانگر غالب ISSR50
3-7- ورود داده‌هاي حاصل از ژل‌ها به نرم افزار اکسل51
3-8- اندازه گيري فواصل و تشابه‌هاي ژنتيکي54
3-9- روش هاي گروهبندي داده ها55
3-10- تجزيه خوشه اي56
3-11- نيکويي برازش خوشه بندي يا ضريب کوفنتيک56
3-12- تجزيه به مولفه هاي اصلي57
3-13- آناليز داده‌هاي مولکولي58
3-14- بررسي‌هاي مورفولوژيکي58
3-15- تجزيه به مؤلفه اصلي60
3-16- آناليز داده‌هاي مورفولوژيکي61
فصل چهارم
نتايج62
بررسي تنوع مرفولوژيکي نژادهاي زنبور عسل مورد مطالعه63
4-2- نتايج مربوط به هفت صفت ظاهري اندازه‌گيري شده روي زنبوران عسل پنج استان ايران63
4-3- همبستگي خصوصيات ظاهري زنبور عسل پنج استان ايران64
4-4- ماتريس‌هاي شباهت و تفاوت بين زنبورهاي پنج استان مختلف ايران65
4-5- تجزيه خوشه‌اي و تجزيه به مولفه‌هاي اصلي بر اساس داده‌هاي مرفومتريک66
4-6- بررسي تنوع ژنتيکي نژادهاي زنبور عسل مورد مطالعه67
4-7- تعداد باندهاي توليدي هر آغازگر براي زنبورهاي استان‌هاي مورد مطالعه72
4-8- تعداد باندهاي توليدي در هر نژاد زنبور عسل72
4-9- تعداد باندهاي توليد هر آغازگر و کارايي آنها در تکثير73
4-10- ماتريس‌هاي شباهت و تفاوت بين زنبورهاي پنج استان مختلف ايران74
4-11- تجزيه خوشه‌اي و تجزيه به مولفه‌هاي اصلي بر اساس داده‌هاي مولكولي74
4-12- بررسي شاخص نشانگري و قدرت تمايز آغازگرهاي مورد مطالعه روي زنبور عسل76
4-13- تعداد کل جايگاه‌هاي ژني و تعداد جايگاه‌هاي ژني چندشکل در زنبورهاي مورد مطالعه77
4-14- دندوگرام اجماعي حاصل از داده‌هاي ژنتيکي و مرفومتريک78
فصل پنجم
بحث و نتيجه‌گيري79
چگونگي کاربرد و آناليز نشانگر ISSR در تنوع ژنتيکي زنبور عسل81
بررسي تنوع ژنتيکي نژادهاي زنبورعسل مورد مطالعه87
پيشنهادات:90
منابع91
فهرست جداول
جدول 2-1: نام‌هاي متفاوت و همنام تکنيک ISSR-PCR31
جدول3-1: مکان و آدرس‌هاي محل نمونه برداري زنبور عسل42
جدول 3-2 مواد واكنش، حجم و غلظت نهايي اجزاي واكنش زنجيره پليمراز48
جدول3-3: صفات مرفولوژيک اندازه‌گيري شده59
جدول 4-1: ميانگين هفت صفت مرفولوژيک زنبوران کارگر مورد مطالعه63
جدول4-2: اندازه هفت صفت مرفولوژيک زنبور عسل پنج استان ايران64
جدول 4-3: همبستگي بين صفات ظاهري اندازه‌گيري شده در زنبور عسل65
جدول 4-4: ضريب فاصله مرفولوژيکي و تشابه مرفولوژيکي بين پنج جمعيت زنبور عسل65
جدول 4-5: ليست آغازگرها، توالي آنها و چند شكلي مشاهده شده در نژادهاي زنبور عسل68
جدول 4-6: تعداد باندهاي توليدي هر آغازگر براي زنبورهاي استان‌هاي مورد مطالعه72
جدول 4-7: ضريب تشابه ژنتيکي و فاصله ژنتيکي بين پنج جمعيت زنبور عسل بر اساس نشانگر ISSR74
جدول 4-8: ميزان برخي شاخص‌هاي آغازگرهاي مورد استفاده در مطالعه تنوع ژنتيکي زنبور عسل76
فهرست اشکال
شکل 2-1: نقاشي کشف شده از زنبورداري در والنسياي اسپانيا6
شکل 2-2: طبقه بندي انواع نشانگرهاي ژنتيکي17
شکل3-1: پنج استان جمع آوري نمونه‌ي زنبور عسل41
شکل3-2: نمايي از مکان‌هاي جمع آوري نمونه‌هاي زنبور عسل42
شکل 3-3: دستگاه حمام آب مورد استفاده در اين آزمايشات43
شکل 3-4: دستگاه سانتريفيوژ مورد استفاده در اين آزمايشات44
شکل 3-5: بررسي کيفيت DNA استخراج شده ژنومي روي ژل آگارز 1 درصد46
شکل 3-6: دستگاه نانودراپ اسپکتروفوتومتر مورد استفاده در تعيين غلظت DNA47
شکل 3-7: برنامه واكنش زنجيره‌اي پليمراز49
شکل 3-8: دستگاه‌هاي PCR مورد استفاده در اين آزمايشات49
شکل 3-9: تانک الکتروفورز ژل آگارز مورد استفاده در اين آزمايشات50
شکل 3-10: دستگاه BioDoc Analyzer و سيستم تصويربرداري از ژل آگارز50
شکل 3-11: باندهاي موجود و نمره‌دهي لوکوس‌هاي موجود حاصل از تصويربرداري ژل‌هاي آگارز نشانگر ISSR51
شکل 3-12: ورود داده‌هاي حاصل از نمره‌دهي ژل‌هاي آگارز به نرم افزار اکسل جهت آناليز51
شکل 3-13: نمايي از بال جلويي زنبور عسل و صفات اندازه‌گيري شده60
شکل 3-14: دستگاه استريوميکروسکوپ مجهز به دوربين مورد استفاده در آزمايشات60
شکل 4-1: دندروگرام حاصل از آناليز خوشه‌اي بر اساس روش UPGMA با ماتريس تشابهCorr 66
شکل 4-2: مقايسه زنبورهاي عسل مورد بررسي با استفاده از روش تجزيه به مولفه‌هاي اصلي67
شکل 4-3: تصاوير ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 1 با استفاده از مارکر bp 5069
شکل 4-4: تصاوير ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 2 با استفاده از مارکر bp 5070
شکل 4-5: تصاوير ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 3 با استفاده از مارکر bp 5070
شکل 4-6: تصاوير ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 4 با استفاده از مارکر bp 5071
شکل 4-7: تصاوير ژل آگارز 5/1 درصد آغازگر 5 با استفاده از مارکر bp 5071
شکل 4-8: تعداد باندهاي توليدي در نژادهاي زنبور عسل73
شکل 4-9: تعداد باندهاي توليدي آغازگرهاي مورد استفاده73
شکل 4-10: دندروگرام حاصل از آناليز خوشه اي بر اساس روش UPGMA با ماتريس تشابه Jaccard 75
شکل 4-11: پلات سه بعدي حاصل از تجزيه به مختصات اصلي به‌روش ماتريس تشابه Jaccard 75
شکل 4-12: تعداد کل جايگاه‌هاي ژني و تعداد جايگاه‌هاي ژني چندشکل 77
شکل 4-13: دندروگرام اجماعي حاصل از داده‌هاي ژنتيکي و مرفولوژيکي78
فهرست معادلات
معادله 3-1: محتواي اطلاعات چندشکلي نشانگر52
در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود
شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید
ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل
معادله 3-2: ميزان چندشکلي نشانگر52
معادله 3-3: ارزشمندي باندها53
معادله 3-4: قدرت حل هر آغازگر53
معادله 3-5: ميانگين قدرت حل هر آغازگر53
معادله 3-6: نسبت چندگانه موثر53
معادله 3-7: شاخص نشانگري54
معادله 3-8: ضريب تشابه جاکارد55
چکيده
نشانگر مولکولي ISSR به منظور جداسازي نژادهاي زنبور عسل Apis mellifera پنچ استان خوزستان، کردستان، مرکزي، اصفهان و فارس مورد استفاده قرار گرفت. استخراج DNA از زنبورهاي كارگر با استفاده از روش بهينه نمکي صورت گرفت و پس از سنجش کمي و کيفي DNA استخراج شده و رقيق سازي آن، مقادير حاصل از باندهاي بدست آمده بر روي ژل آگارز 5/1 درصد نمره‌دهي و آناليز صورت گرفت. نتايج نشان داد که باندهاي آغازگرهاي مورد مطالعه شده در محدودهي 150 جفت باز تا 1000 جفت باز قرار دارند و بيشترين تعداد باند مشاهده شده مربوط به آغازگر 1 و کمترين آنها مربوط به آغازگر 3 و 4 بوده است. آناليز خوشه‌اي نژادهاي مورد مطالعه آنها را در دو گروه اصلي قرار داد. در گروه اول فارس و در گروه ديگر که به دو زير گروه تقسيم شده يکي شامل اصفهان و ديگري شامل مرکزي، خوزستان و کردستان، دو استان کردستان و خوزستان داراي بيشترين شباهت بودند. به نظر مي‌رسد نشانگر ISSR بتواند به خوبي نژادهاي زنبور عسل با منشاء مختلف را از هم جدا سازد.
واژه‌هاي کليدي: نشانگر مولکولي، زنبور عسل، بهينه نمکي، تنوع ژنتيكي
فصل اول
مقدمه
مقدمه
براساس آمار سازمان خواربار جهاني بيش از هفتاد ميليون کلني زنبور عسل در جهان وجود دارد که محصولات توليدي آنها در راستاي تامين نيازهاي غذايي، دارويي و بهداشتي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. بعلاوه زنبور عسل با گرده افشاني گياهان زراعي و باغي نقش بسيار مهمي در افزايش محصولات کشاورزي و پايداري محيط زيست ايفا مي‌کند. در بين حشرات گرده افشان زنبور عسل بدليل حمايت بشر، جمعيت بيشتر کلني و جابجايي کلني‌ها براي توليد محصول بيشتر و دامنه فعاليت وسيع‌تر، خصوصيات بيولوژيکي، رفتاري و مرفولوزيک خاص بهترين نقش را ايفا مي‌کند و از اهميت بالاتري برخوردار است. منطقه‌ي انتشار طبيعي زنبور عسل در جهان محدودهي وسيعي است که از شمال به جنوب کشور هاي اسکانديناوي، از غرب به داکار، از جنوب به دماغه اميدنيک و از شرق به کوه‌هاي اورال، مشهد و عمان محدود مي‌شود، البته اين حشره توسط انسان به ساير نقاط جهان نيز منتقل شده است (طهماسبي و همکاران، 1378). از زمان آشنايي بشر با زنبور عسل توليدات آن بويژه عسل همواره به عنوان يک ماده‌ي غذايي ايده‌آل مورد توجه بوده است. عسل در فرهنگ عامه به عنوان يکي از شفابخش‌ترين فراورده‌هاي غذايي مطرح است. بررسي‌ها نشان ميدهد که محصولات کندو و از جمله عسل علاوه بر مغذي بودن، داراي اثرات درماني نيز مي‌باشد (توپچي و علمي، 1388). براي توليد بيشتر عسل نياز به جمعيت‌هاي قوي مي‌باشد و توليد جمعيت‌هاي قوي نيز در سايه‌ي مديريت صحيح بر پايه‌ي دانش علمي ممکن مي‌باشد. يکي از مسائلي که ممکن است باعث اثرات نامطلوب و در نتيجه تضعيف کلني‌ها گردد، پديده‌ي تلاقي‌هاي خويشاوندي مي‌باشد که منجرب به افزايش هم‌خوني يا هموزيگوتي آلل‌هاي جنسي مي‌گردد (Mayer, 1996).
تعيين وضعيت ژنتيکي موجودات زنده زيربناي اصلاح نژاد آنها در هر منطقه است براي تعيين اين وضعيت و تفکيک توده‌هاي مختلف زنبور عسل در يک منطقه از روشهاي مرفولوژيکي، تنوع پروتئين‌ها و DNA نگاري استفاده مي‌شود (طهماسبي و همکاران، 1376). برخي از تفاوت‌هاي موجود در رديف DNAبين دو موجود ممکن است به صورت پروتئين‌هايي با اندازه‌هاي مختلف تجلي کنند که بروش‌هاي مختلف بيوشيميايي قابل ثبت و رويت و مطالعه مي‌گردند. اين قبيل نشانگرها را نشانگرهاي مولکولي در سطح پروتئين مي‌نامند که از آن جمله مي‌توان به سيستم آيزوزايم/ آللوزيم اشاره کرد. اما دسته‌ي ديگر از تفاوت‌هاي موجود در سطح DNA هيچ تظاهري ندارند، نه صفت خاصي را کنترل ميکنند و نه در رديف اسيدهاي آمينه پروتئين‌ها تاثيري برجاي مي‌گذارند. اين دسته از تفاوت‌ها را مي‌توان با روشهاي مختلف شناسايي، قابل ديدن و رديابي کرد و به عنوان نشانگر مورد استفاده قرار داد. اين نشانگرها که تقريباً تعدادشان نامحدود است فقط از راه تجزيه وتحليل مستقيم DNA قابل ثبت هستند و بنابراين به آنها نشانگرهاي مولکولي در سطح DNA گفته مي‌شود. طي ساليان اخير شناسايي و بررسي تنوع ژنتيك در بين گونه‌هاي حشرات بر اساس نشانگرهاي مولكولي و روشهاي مبتني بر واكنش زنجيره‌اي پليمراز PCR بسيار متداول گشته است. ولي در كشور ما بررسي تنوع مولكولي در زمينه حشره شناسي بسيار كم انجام گرفته است. امروزه ميکروساتليت‌ها نقش مهمي در تعيين تنوع ژنتيکي و روابط خويشاوندي جانوران و گياهان و مخصوصاً حشرات ايفا ميکنند. استفاده از نشانگر ISSR بيشتر جهت تنوع ژنتيکي گياهان استفاده شده و در جهان حشرات هم اکنون استفاده از اين نشانگر جهت بررسي تنوع ژنتيکي راسته بالپولکداران به ويژه دو خانواده Noctuidae و Bombycidae ، راسته دوبالان و بال غشائيان در کانون توجه مجامع علمي قرار گرفته است(Luque, et al., 2002; Hundsdoerfer, et al., 2005; Radjab, et al., 2012).
اهداف كلي در اين تحقيق عبارتند از :
* بهينه سازي کاربرد نشانگر ISSR در بررسي تنوع ژنتيکي زنبور عسل.
* ارزيابي ميزان خويشاوندي نژادهاي زنبور عسل ايران نسبت به يکديگر.
* بررسي کارايي نشانگر ISSR در جداسازي و دسته بندي روابط خويشاوندي زنبور عسل ايران.
* بررسي تفاوت و تشابه نتايج بدست آمده از مطالعه نشانگر ISSR و نتايج بدست آمده از خصوصيات مورفولوژيک زنبور عسل.
فصل دوم
بررسي و مرور منابع
2-1- تاريخچه زنبور عسل1 و پرورش آن در جهان و ايران
(((((((((( (((((( ((((( ((((((((( (((( ((((((((( (((( ((((((((((( (((((((( (((((( ((((((((( ((((((( ((((((((((( ((((
قديمي‌ترين زنبور عسل حفظ شده در کهربا در منطقه‌اي از ميانمار برمه کشف شده است که عمر اين فسيل به 100 ميليون سال پيش در دورهي کرتاسه2 باز مي‌گردد که دورهي زندگي دايناسورها بوده است، بنابراين قدمت زنبورها از قاره‌ي استراليا نيز بيشتر است، البته اين زنبورهاي کشف شده داراي زندگي اجتماعي نبوده‌اند. نگهداري عسل توسط زنبورهاي اجتماعي در دورهي ميوسن3 در حدود 20-10 ميليون سال قبل گسترش يافته است (Campbell and Campbell, 2007)و کهن‌ترين نمونه زنبور عسل در موزهي تاريخ طبيعي نيويورک مربوط به 20 ميليون سال پيش است (سعادتمند، 1389).
نقاشي‌هايي بروي غاري در والنسياي اسپانيا کشف شده که در آنها براي رسيدن به لانه از نردبان و ظروفي براي نگه داشتن عسل به تصوير کشيده شدهاند (شکل2-1).
شکل 2-1: نقاشي کشف شده از زنبورداري در والنسياي اسپانيا
اولين تصوير از پرورش زنبور عسل مربوط به 2400 سال قبل از ميلاد بدست آمده است که در آن تصوير زنبورها داراي 4 پا و 2 بال هستند و اينک در موزهي لوور پاريس نگهداري مي‌شود. مصريان باستان عسل را در مراسم مذهبي، تغذيه حيوانات مقدس و در بسياري از تشريفات ديگر و حتي حفظ اجساد، مورد استفاده قرار مي‌دادند(Crane, 2004) . دست نوشته‌هايي از مصريان باستان مربوط به 3000 سال قبل وجود دارد که فعاليت‌هاي پرورش زنبور عسل در آن به ثبت رسيده است (Campbell and Campbell, 2007).
در کتاب‌هاي فارسي و هندي از جمله کتاب ابن‌سينا و کتاب مقدس هندو به نام ودا که 3-2 هزار سال قبل از ميلاد مسيح به زبان سانسکريت نوشته شده است، از زنبور عسل با احترام ياد مي‌شود. شينو به اعتقاد پيروان مکتب هندو، به عنوان حامي و محافظ پرقدرت خداي دو، از خدايان سه گانه هندوئيسم بوده که به شکل زنبور عسل آبي رنگ در يک گل نيلوفر آبي مجسم مي‌شود. خداي عسل بوميان هند شرقي به نام کاما است، که کماني در دست دارد و زه اين کمان متشکل از زنبورهاي بسيار و درهم تنيده است (سعادتمند، 1389). در نسخه‌هاي خطي اروپائيان عسل به عنوان غذا، دارو، نوشيدني و اهداف مختلف نگهداري مواد و همچنين در مراسم‌هاي مذهبي توصيف شده است. در بسياري از فرهنگ‌‌ها عسل خوردني نيست، اما يک نوشيدني الکلي با استفاده از تخمير قند عسل مي‌سازند و مصرف ميکنند.
تا حدود سال 1500ميلادي زنبورها طي فرايند جمع آوري عسل در مکان زندگي خود کشته مي‌شدند، پس از آن زمان اروپائيان تکنيکهاي زنبورداري را گسترش دادند.
زنبورداري در ايران سابقه‌اي ديرينه داشته و يکي از حرفه‌هاي اصيل و قديمي ايراني‌ها است، دشنه مفرغي منقش به شکل زنبور عسل متعلق به 800 سال قبل از ميلاد که در لرستان بدست آمده است وهم اکنون در موزهي شهر بروکسل نگهداري مي‌شود، معرف قدمت آشنايي ايراني‌ها با اين حشره‌ي مفيد است. با جستجوي کلمه عسل و احتمالاً زنبور عسل در اشعار به خصوص شعرهاي قديمي مي‌توانيم از قدمت و آشنايي ايراني‌ها با زنبور عسل پي‌برد (آقايي نراقي، 1388).
ابن مقيصه از پيامبر اکرم(ص) نقل مي‌کند که عسل درمان هر بيماري است و قران درمان تمام بيماري‌هاي ذهن است، بنابراين من به شما توصيه هر دو درمان عسل و قران را دارم (Campbell and Campbell, 2007).
2-2- ارزش اقتصادي زنبور عسل
آلبرت چي کاکس مي‌نويسد: که هيچ جاندار ديگري به اندازه‌ي زنبور عسل به طرق مختلف به انسان خدمت نمي‌کند. زنبور عسل نقش بسيار مهمي در گرده افشاني بيش از 90 گياه (Al-Otaibi, 2008) در نتيجه بقا، گونه و همچنين افزايش کمي و کيفي محصولات آنها دارد، علاوه بر اين زنبور عسل خود داراي توليدات متنوعي مانند عسل، موم، بره موم، ژله، رويال و زهره نيز مي‌باشد. توليد عسل مهمترين صفت اقتصادي زنبور عسل مي‌باشد (مستاجران، 1379). امروزه نقش عظيم زنبور عسل در گرده افشاني گياهان زراعي و باغي و احياي مراتع و بهبود محيط زيست به حدي شناخته شده و آشکار مي‌باشد که توليدات آن يعني عسل و غيره را تحت شعاع قرار ميدهد. اساساً نباتات از نظر گرده افشاني وابسته به حشرات هستند که در رأس آنها زنبور عسل قرار دارد، به عبارت ديگر گرده افشاني 47 درصد از محصولات کشاورزي وابسته به زنبور عسل است، به همين دليل ارزش اقتصادي زنبور عسل در دنيا 100-25 برابر ارزش عسل توليد شده در سال محاسبه مي‌شود. به گفته‌ي Mc. Gregor پژوهشگر امريکايي در سال 1973، زارعين امريکا بيش از 40 ميليارد دلار سود از افزايش محصولات زراعي در رابطه با گرده افشاني نباتات دگرگشن4 داشته‌اند که نقش مهمي از اين آزمايش به عهده‌ي زنبور عسل است. زنبور عسل جز گرده افشان‌هاي اصلي گياهان روغني خصوصاً آفتابگردان مي‌باشد، نتيجه‌ي يک طر ح تحقيقاتي در همين رابطه در کشور امريکا که استقرار 2 کندو به ازاي هر هکتار آفتابگردان سبب افزايش چشمگير محصول شده، به طوري که محصول بدست آمده در مزرعه تحت آزمايش 50-20 درصد بيشتر از مزارع شاهد بوده است (ميراب‌زاده، 1372).
در ايران نزديک به 6/4 ميليون کندوي مدرن با توليد متوسط 38/9 کيلوگرم عسل به ازاي هر کندو در سال وجود دارد به اين ارقام مي‌بايست 380 هزار کندوي بومي با توليد 04/4 کيلوگرم عسل براي هر کندو در سال افزود. بنابراين توليد عسل ساليانه کشور را در حدود 45 هزار تن محاسبه نموده و ارزش ريالي آن را حدود 800 ميليارد مي‌دانند. حال چنانچه ارزش گرده افشاني را به آن بيافزائيم ارزش اقتصادي واقعي زنبور عسل بالغ بر 20 تريليون ريال خواهد بود (آمارنامه وزارت جهاد کشاورزي، 1389).
2-3- جايگاه سيستماتيک زنبور عسل
زنبور عسل به رده‌ي حشرات5، راسته‌ي بال غشائيان6 و خانواده‌ي Apidae، جنس Apis و گونه A. mellifera تعلق دارد. راسته‌ي بال غشائيان که زنبور عسل به اين راسته تعلق دارد، بزرگترين راسته پس از راسته سخت بال پوشان7 است. اين راسته داراي مفيدترين حشرات براي انسان است، داراي گونه‌هايي است که از نظر انگلي8، شکارچي9 و گرده افشاني10 نقش مهمي دارد.
Kingdom: Animalia
Phylum: Arthropoda
Sub Class: Insecta
Order: Hymenoptera
Super family: Apoidea
Family: Apidae
Genus: Apis
Species: Apis mellifera L.
چها گونه اصلي زنبور عسل براساس جثه عبارتند از A. dorsata، A. mellifera، A. cerena، A.florea که کشور ايران ميزبان دوگونه A. mellifera، A.florea مي‌باشد. گونه‌ي A. mellifera تنها گونه‌اي مي‌باشد که بيشترين قدرت سازگاري11 را برخوردار مي‌باشد. زير گونهها با نژادهاي اين گونه 24 عدد مي‌باشند، نژاد زنبور عسل ايراني با نام A. mellifera medaمي‌باشد. تنها 4 نژاد از اين نژادها متعلق به نژادهاي اقتصادي مي‌باشندکه در اغلب برنامههاي اصلاح نژادي جهان از اين نژادهاي برتر استفاده مي‌گردد (بصيري، 1386) که عبارتند از: زنبور عسل معمولي سياهA. mellifera mellifera ، زنبور عسل معمولي ايتاليايي A. mellifera ligustica، زنبور عسل معمولي قفقازي A. mellifera caucasina، زنبور عسل معمولي اروپايي A. mellifera carnica. اين نژادها و هيبريدها در طول اين سال‌ها با نژاد بومي ايران آميخته شده و مي‌توان گفت تقريباً در تمام مناطق زنبورداري ايران جايگزين شدهاند (عبادي، 1366).
2-4- اصلاح نژاد در زنبور عسل
معمولاً هدف اصلي اجراي برنامههاي اصلاح نژاد زنبور عسل، افزايش توليد محصولاتي مانند عسل، گرده، رويال و غيره است در ضمن آرام بودن و تمايل به بچه دادن، از ويژگي‌هاي يک کلني زنبور عسل است. مقدار عسل به جمعيت و فعاليت کلني بستگي دارد، جمعيت کلني نيز به ظرفيت تخم گذاري ملکه، قابليت زنده ماندن نوزادان و طول عمر زنبورهاي کارگر وابسته است، براي نيل به چنين هدفي بايد با آگاهي از نحوه‌ي توارث صفات، وراثت پذيري و همبستگي ژنوتيپي و فنوتيپي بين آنها براي انتخاب و آميزش برنامه‌ريزي شود (بصيري، 1386). اصلاح نژاد زنبور عسل بدليل ويژگي‌هاي خاص اين موجود، داراي پيچيدگي‌‌هاي خاصي در مقايسه با ساير حيوانات است (Woyke, 1986).
يکي از اين ويژگي‌ها مکانيسم ژنتيکي تعيين جنسيت در زنبور عسل مي‌باشد که محدوديت‌هاي شديدي را در سيستم‌هاي اصلاح نژادي ايجاد مي‌کند (Woyke, 1988; Page et al., 1982). تعيين جنسيت12 در اکثر موجودات زنده بويژه پستانداران به وسيله کروموزوم‌هاي جنسي صورت مي‌پذيرد، به طوريکه از اجتماع دو کروموزوم جنسي X جنس ماده (XX) و از دو کروموزوم جنسي X و Y جنس نر (XY) بوجود مي‌آيد. ولي در زنبور عسل برخلاف اکثر موجودات زنده، تعيين جنسيت به وسيله آلل‌هاي جنسي چندگانه در زنبور عسل انجام مي‌پذيرد (Woyke, 1986; Ruttner, 1988). تعداد اين ژن‌ها يا آلل‌هاي جنسي در جوامع مختلف متفاوت است و در بررسي‌هاي متعدد آنها بين 20-6 آلل براورد شده است (Woyke, 1986) (سپهري و همکاران، 1386). ولي بايد توجه داشت که زنبوران کارگر و ملکه فقط حامل يک جفت و زنبوران نر هاپلوئيد تنها حامل يک نوع از آلل‌هاي جنسي چندگانه هستند (ميرزايي و همکاران، 1384).
بنابراين تعيين جنسيت در زنبور عسل به وسيله‌ي آلل‌هاي جنسي به يکي از سه حالت زير اتفاق مي‌افتد: الف) اگر در تخم‌هاي لقاح يافته دو آلل جنسي مختلف aو b در يک مکان ژني به صورت هتروزيگوت13 قرار گيرند. از اين تخم‌ها زنبوران ماده (ملکه يا کارگر) تکامل مي‌يابند، که از نظر ژنتيکي ديپلوئيد بوده و تخم آنها توسط ملکه کلني در سلول‌هاي کارگر گذاشته مي‌شوند(Woyke, 1976, 1986) .
ب) اگر در تخم‌هاي لقاح نيافته تنها يک نوع آلل جنسي مثل a در يک مکان ژني به صورت هميزيگوت14 باشد، از اين تخم‌ها براثر پديده بکرزايي15، زنبوران نر هاپلوئيد بوجود مي‌آيند. چنين تخم هايي توسط ملکه کلني در سلول‌هاي نر تخم‌‌ريزي مي‌شوند(Woyke, 1976, 1986) .
ج) در مورد آميزش‌هاي خويشاوندي، اگر در تخم‌هاي لقاح يافته دو آلل جنسي مشابه مثل aو a در يک مکان ژني به صورت هموزيگوت16 قرار گيرند، از اين تخم‌ها نرهاي ديپلوئيد بوجود مي‌آيند. ملکه تخم نرهاي ديپلوئيد را در سلول‌هاي کارگر تخمگذاري مي‌کند. البته نرهاي ديپلوئيد به طور طبيعي قادر به ادامه حياط نيستند چرا که لارو نرهاي ديپلوئيد فاقد فرمون ترشح شده توسط نوزادان طبيعي هستند به همين دليل حدود 6 ساعت بعد از تفريخ از تخم، توسط زنبوران کارگر از بين مي‌روند(Woyke, 1976, 1986) .
توليد جمعيت قوي زنبور عسل براي توليد بيشتر در سايه‌ي مديريت صحيح بر پايه‌ي دانش علمي ممکن مي‌باشد (اسعدي ديزجي و همکاران، 1387). يکي از مسائلي که ممکن است باعث اثرات نامطلوب و در نتيجه تضعيف کلني‌ها گردد، پديده‌ي تلاقي‌هاي خويشاوندي مي‌باشد که منجرب به افزايش هم‌خوني يا هموزيگوتي آلل‌هاي جنسي مي‌گردد (Mayer, 1996). اين مسئله به طور کلي باعث کاهش قدرت زنده‌ماني نوزادان، حساسيت به بيماري‌ها، کاهش بازده و عملکرد، بروز صفات و رفتارهاي نامطلوب و عوارض متعدد ديگري مي‌گردد (Ruttner, 1988; Mirsha and Kumar, 1992) (ميرزايي و همکاران، 1384).
براي برنامه ريزي اصولي اصلاح نژادي، اولين قدم مشخص کردن وضعيت ژنتيکي زنبور عسل در کشور است. اين کار به روشهاي مختلفي در دنيا صورت مي‌گيرد، که در بين آنها مي‌توان به استفاده از خصوصيات ظاهري، تنوع پروتئين‌ها و خصوصيات DNA اشاره نمود (طهماسبي و همکاران 1378). بررسي‌ها نشان ميدهد که تاکنون در ايران، فعاليت چنداني در مورد اصلاح نژاد زنبور عسل صورت نگرفته است، اما به سبب وارد کردن ملکه‌هاي خارجي بدون کنترل صحيح در دهه‌هاي گذشته اجراي برنامههاي اصلاح نژادي براي زنبور عسل امري ضروري است (بصيري، 1386).
2-5- ژنوم زنبور عسل
پروژه تعيين توالي ژنوم زنبور عسل با حمايت مالي اوليه موسسه ملي بهداشت و درمان ژنوم انساني با کمک وزارت کشاورزي ايالات متحده، در دسامبر 2002 آغاز شد. نتايج حاصل از اين تلاش به رهبري کالج بيلور مرکز پزشکي تعيين توالي ژنوم بشر و با مشارکت بيش از 100 آزمايشگاه تحقيقاتي از 16 کشور، در بيش از 50 مقاله در بسياري از مجلات برجسته علمي منتشر شد. براين اساس ژنوم زنبور عسل در مجموع داراي حدود 250 ميليون پايگاه‌هاي DNA است. براساس برنامههاي کامپيوتري ژن تاکنون بيش از 10هزار مکان ژني تشخيص داده شده است، که اين کمتر از 13 هزار ژن‌هاي شناسايي شده از ژنوم مگس ميوه17 که يکي از فشرده‌ترين ژنوم مورد مطالعه در زيست شناسي بوده است. انتظار مي‌رود که تعداد ژن‌هاي شناسايي شده در ژنوم زنبور عسل در آينده افزايش يابد. ژنوم زنبور عسل شامل ميزان بيشتري از نوکلئوتيد آدنين18 و تيمين19 نسبت به ژنوم مگس ميوه است. اين وضعيت دقيقاً در مقابل ژنوم انسان، که ژنوم آن حاوي نسبت‌هاي بيشتري از نوکلئوتيد گوانين20 و سيتوزين21 است قرار مي‌گيرد.
2-6- تعريف نشانگر
استفاده از نشانگرهاي ژنتيکي قدمتي برابر با تاريخ بشر دارد. انسان‌هاي نخستين، حتي آنهايي که هنوز کشاورزي را فرا نگرفته بودند و براي ادامه زندگي مجبور به جمع آوري بذر و ميوه گياهان بودند، بدون اينکه خود بدانند از نشانگرهاي مرفولوژيک براي شناختن و تمايز انواع بذر و ميوه وجانوران وحشي استفاده مي‌کردند و برخي را به ديگري ترجيح مي‌دادند اما به صورت مدون و دانش‌مدار، شايد مندل نخستين کسي بود که از نشانگرهاي مرفولوژيک يا نشانگرهاي مبتني بر فنوتيپ22 براي مطالعات چگونگي توارث صفات در نخود فرنگي استفاده کرد. به طور کلي هر صفتي که بين افراد متفاوت باشد، ناشي از تفاوت موجود بين رديف‌هاي DNA کروموزوم‌هاي آنها است که به نتايج نيز منتقل مي‌شود، حتي صفاتي که تحت تاثير شرايط محيط نيز به صورت متفاوت بروز ميکنند (تفاوت در بين افراد در شرايط محيطي يکسان)، بازتاب تفاوت‌هاي موجود در رديف‌هاي DNA هستند. اين تفاوت‌ها مي‌توانند به عنوان نشانه يا نشانگر ژنتيکي به کار گرفته شوند (نقوي و همکاران، 1388).
2-6-1- نشانگرهاي مرفولوژيک
اين تفاوت‌ها ممکن است به طرق مختلفي تظاهر يابند، برخي از اين تفاوت‌ها در صفات قابل رويتي مانند رنگ گل، وجود يا عدم وجود ريشک در گلچه غلات، صاف يا چروک بودن سطح دانه‌ي نخود فرنگي در آزمايش‌هاي مندل تجلي ميکنند. اين گونه نشانه‌ها را نشانگرهاي مرفولوژيک مي‌نامند (نقوي و همکاران، 1388).
2-6-1-1- نشانگرهاي مرفولوژيک و زنبور عسل
بررسي‌هاي روتنر و همکاران روي نژادهاي زنبور عسل جهان، با استفاده از خصوصيات ظاهري متعدد و با استفاده از روش آماري تجزيه به مولفه‌ي اصلي23، نژادهاي مختلف را به خوبي از يکديگر متمايز کرد. در مطالعات وي نژادهاي اروپايي (مانند کارنيولان و قفقازي) با جثه‌هاي بزرگتر در سمت راست محور ترسيم شده و نژادهاي آفريقايي (مانند يمني24 و مصري) در سمت چپ محور قرار مي‌گيرد. در اين بررسي نژاد ايراني در وسط اين محور قرار گرفته است (Ruttner et al., 1978).
مطالعات عبدالطيف و همکاران روي توده زنبور عسل عراق، با استفاده از دوازده صفت ظاهري، نشان داد که زنبور عسل موجود در عراق جمعيتي از نژاد زنبور عسل سوري25 است (Abdellatif et al., 1977).
داتون و همکاران در بررسي‌هاي خود روي توده‌هاي زنبور عسل عمان نتيجه گرفتند که اولاً دو جمعيت کاملاً مجزا در شمال و جنوب اين کشور وجود دارد و ثانياً توده موجود در عمان به نژادهاي آفريقايي از جمله نژاد يمني شباهت زيادي داشته و با نژادهاي آسيايي فاصله بيشتري دارد (Dutton et al., 1981).
عطاا… و همکاران در مقايسه نژاد مصري با کارنيولان و ايتاليايي نتيجه گرفتند که کارگران نژاد مصري در يازده صفت و نرها در 3 صفت با دو نژاد اروپايي تفاوت معني داري دارند ولي ملکه هاي سه نژاد فاقد تفاوت معني‌دار هستند (Atallah et al., 1988).
ميکسنر و همکاران در بررسي‌هاي مرفولوژيک خود روي توده‌هاي زنبور عسل موجود در کنيا به اين نتيجه رسيدند که در ارتفاعات بالاي 2000 متر، نژاد مونتي‌کولا26 و در ارتفاعات زير 2000 متر نژاد اسکوتلاتا27 و در منطقه حد واسط مخلوطي از دو نژاد زندگي ميکنند (Meixner et al., 1994).
در بررسي‌هاي دالي و همکاران مشخص شد که ارتفاع محل زيست روي صفات مربوط به اندازه بدن مثل طول بال، اندازه زواياي بال، طول رگبال‌ها و اندازه غدد موم‌ساز تأثير مي‌گذارد (Daly et al., 1991). بطوريکه در ارتفاعات پايين‌تر و هواي خشک و گرم اندازه صفات مذکور کاهش مي‌يابد. همچنين در بررسي‌هاي ميکسنر و روتنر مشخص شد که شرايط اقليمي و ارتفاع روي صفات ظاهري تأثير مي‌گذارد و با افزايش ارتفاع محل زيست زنبورها، طول بدن و طول موهاي روي بدن آنها افزايش مي‌يابد (Mixner, 1992; Ruttner et al., 1978).
در بررسي‌هاي طهماسبي و همکاران مشخص شد که زمان و فصل روي صفات طول و عرض بال جلو، ايندکس کوبيتال، زاويه A4، طول خرطوم، طول پاي عقب، طول نيم حلقه سوم و چهارم شکمي، رنگ سپرچه، رنگ نيم حلقه سوم و چهارم شکمي تأثير مي‌گذارد ولي روي زواياي D7 و G18 تأثير نداشته است. در ايران واردات ملکه‌هاي خارجي از سال 1340 باعث آميخته شدن توده بومي با نژادهاي خارجي شده است. از سوي ديگر به علت قطع واردات در دهه‌هاي اخير، انتظار مي‌رود تثبيت ژنتيکي نسبي در توده موجود صورت گرفته باشد. طهماسبي و همکاران دريافتند که به دليل پايداري نژاد ايراني، اين نژاد هويت خود را از دست نداده و حتي در سال‌هاي اخير ويژگي‌هاي نژاد ايراني بيشتر تثبيت گرديده است.
علاوه بر شرايط محيطي، عوامل ديگري که مي‌تواند باعث اين تفاوت‌ها شود اختلافات اقليمي حاصل از تغييرات فصل است. تفاوت‌هاي نوع دوم مي‌تواند باعث خطا در برآوردهاي مربوط به تفاوت‌هاي حاصل از شرايط محيطي شود. تحقيقات انجام شده در کشورهاي ديگر نشان دهنده اين است که شرايط فصلي روي صفات مورفولوژيک بال جلويي زنبور عسل تأثير مي‌گذارد که ميزان تحت تاثير قرار گرفتن صفات و تنوع ايجاد شده در صفات مختلف بال جلويي بين 29-3 درصد بوده است (Nazzi, 1992). مطالعه انجام شده ديگر نيز نشان ميدهد که آلودگي به کنه واروا در فصول مختلف روي بال جلويي زنبور عسل تاثير مي‌گذارد. به طوري که در آلودگي‌هاي مربوط به 5-4 کنه در هر سلول يا بيشتر همبستگي منفي بين تعداد کنه و اندازه مربوط به بال جلو وجود دارد که دليل آن مي‌تواند کاهش پروتئين ذخيره و تاثير آن روي اسکلت خارجي باشد (Daly et al., 1988).
2-6-2- نشانگرهاي مولکولي
برخي از تفاوت‌هاي موجود در رديف DNAبين دو موجود ممکن است به صورت پروتئين‌هايي با اندازه‌هاي مختلف تجلي کنند که بروش‌هاي مختلف بيوشيميايي قابل ثبت و رويت و مطالعه مي‌گردند. اين قبيل نشانگرها را نشانگرهاي مولکولي در سطح پروتئين مي‌نامند که از آن جمله مي‌توان به سيستم آيزوزايم/ آللوزيم اشاره کرد. اما دسته‌ي ديگر از تفاوت‌هاي موجود در سطح DNA هيچ تظاهري ندارند، نه صفت خاصي را کنترل ميکنند و نه در رديف اسيدهاي آمينه پروتئين‌ها تاثيري برجاي مي‌گذارند. اين دسته از تفاوت‌ها را مي‌توان با روشهاي مختلف شناسايي، قابل ديدن و رديابي کرد و به عنوان نشانگر مورد استفاده قرار داد. اين نشانگرها که تقريباً تعدادشان نامحدود است فقط از راه تجزيه وتحليل مستقيم DNA قابل ثبت هستند و بنابراين به آنها نشانگرهاي مولکولي در سطح DNA گفته مي‌شود (نقوي و همکاران، 1388).
پس به صور کلي براي اينکه صفتي به عنوان نشانگر ژنتيکي مورد استفاده قرار گيرد بايد حداقل دو ويژگي زير را داشته باشد:
الف) در بين دو فرد متفاوت باشد (چند شکلي28 نشان دهد).
ب) به توارث برسد.
شکل 2-2: طبقه بندي انواع نشانگرهاي ژنتيکي
2-7- نشانگرهاي مولکولي و حشرات
حشرات بزرگترين ترکيب گونهها در کل سلسله جانوران را تشکيل مي‌دهند و داراي تنوع ژنتيکي گسترده‌اي هستند که مي‌توان با استفاده از تکنيکهاي مارکر مولکولي کشف و استخر ژن به کاوش در آنها پرداخت (Behura, 2006). روند کنوني استفاده از تکنيکهاي مارکر DNA در حوزه‌هاي گوناگون از مطالعات زيست محيطي حشرات نشان ميدهد که نشانگرهاي DNA ميتوکندري29، ميکروستلايت، DNA چند شکل تکثير شده تصادفي30، ابراز برچسب دنباله31 و طول قطعات حاصل از تکثير32 به ميزان قابل توجهي براي پيشرفت در جهت درک اساس ژنتيکي تنوع حشرات، جايگاه صفت کمي در حشرات و نقشه برداري ژن‌ها در پزشکي و کشاورزي دخالت داشته‌اند (Behura, 2006). جداي از اين سيستم نشانگرهاي پرمصرف، روش جديد ديگر از جمله توالي خاص پلي مورفيسم تکثير33 و نشانگرهاي مرتبط با واکنش زنجيره‌اي پليمراز به عنوان سيستم نشانگرهاي جايگزين در مطالعات شناسايي حشرات شناخته شدهاند.
طي ساليان اخير شناسايي و بررسي تنوع ژنتيك در بين گونه‌هاي حشرات بر اساس نشانگرهاي مولكولي و روشهاي مبتني بر واكنش زنجيره‌اي پليمراز34 بسيار متداول گشته است. ولي در كشور ما بررسي تنوع مولكولي در زمينه حشره شناسي بسيار كم انجام گرفته است. امروزه ميکروساتليت‌ها نقش مهمي در تعيين تنوع ژنتيکي و روابط خويشاوندي جانوران و گياهان و مخصوصاً حشرات ايفا ميکنند. استفاده از نشانگرها بيشتر جهت تنوع ژنتيکي گياهان استفاده شده و در جهان حشرات هم اکنون استفاده از اين نشانگر جهت بررسي تنوع ژنتيکي راسته بالپولکداران به ويژه دو خانواده Noctuidae و Bombycidae در کانون توجه مجامع علمي قرار گرفته است(Radjabi et al., 2012). نشانگرهاي مولکولي در مقايسه با نشانگرهاي فنوتيپيک سنتي چندين مزيت دارد که از آن جمله مي‌توان به موارد زير اشاره کرد:
* عدم تاثيرپذيري بوسيله محيط
* قابل يافت شدن در تمام مراحل نموي
* در برگيرنده کل ژنوم
2-8- کاربرد اصلي نشانگرهاي مولکولي در مطالعات اکولوژيکي حشرات
بررسي‌هاي اکولوژيکي روي گونه‌هاي مختلف موجودات مانند حشرات، اطلاعات بسيار با ارزشي را در زمينه‌هاي ساختار جمعيتي، گونه‌زايي، جريان ژني35 و تنوع ژنتيکي فراهم مي‌آورد. اين بررسي‌ها همچنين اطلاعات لازم جهت توجيه ايجاد تنوع در حشرات در اثر تاثيرات متقابل با فاکتورهاي محيطي را فراهم مي‌آورد. در بسياري از موارد وقتي که هيچ راه دقيقي جهت تشخيص گونه‌هاي مختلف وجود ندارد، استفاده از داده‌هاي نشانگرهاي مولکولي بسيار راه‌گشا خواهد بود. نشانگرهاي مولکولي کاربردهاي بيشماري در زمينه‌هاي مختلف اکولوژيکي حشرات ايفا ميکنند که به برخي از آنها اشاره مي‌شود (حسيني، 1389).
444
444
4.1.
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.
4.6.
4.7.
4.8.
4.9.
4.10.