3-1- بررسي و شماره گذاري کلني ها ………………………………………………………………………………. 68
3-2- نتايج اعداد جذب محلول هاي استاندارد سولفات آمونيوم در طول موج nm490 …………… 69
3-3- بررسي اعداد جذب آمونياک آزاد شده در محلول هاي به دست آمده از کلني هاي جهش
يافته ……………………………………………………………………………………………………………………………… 70
3-4- جداسازي و تکثير ژن آنزيم ال-آسپاراژيناز ll ……………………………………………………………. 72
3-5- تعيين توالي قطعه ژني l-aspsraginase ll …………………………………………………………….. 74
3-6- وارد کردن قطعه ژني l-asparaginase ll در وکتور pET23a و تأييد آن …………………. 76
3-7- نتيجه SDS-PAGE نمونه هاي آنزيمي ال-آسپاراژيناز ll , l و استاندارد ………………………… 79
3-8- محاسب? فعاليت آنزيمي(IU) ال-آسپاراژينازll نوترکيب، ال-آسپاراژينازl و ال-آسپاراژيناز
استاندارد ……………………………………………………………………………………………………………………….. 80
3-9- تعيين پروتئين کلّي (mg) آنزيم هاي ال-آسپاراژينازll نوترکيب، ال-آسپاراژينازl و ال-
آسپاراژيناز استاندارد ………………………………………………………………………………………………………… 82
3-10- تعيين فعاليت ويژه( IU/mg ) آنزيم هاي ال-آسپاراژينازll نوترکيب، ال-آسپاراژينازl و
ال-آسپاراژيناز استاندارد ………………………………………………………………………………………………….. 84
3-11- بررسي تأثير آنزيم ال-آسپاراژينازll (نوترکيب)، ال-آسپاراژينازl و آنزيم استاندارد بر سلول
هاي سرطاني HeLa ………………………………………………………………………………………………………. 85
3-12- بررسي تأثير آنزيم ال-آسپاراژينازll (نوترکيب)، ال-آسپاراژينازl و آنزيم استاندارد بر سلول
هاي سرطاني LCL ……………………………………………………………………………………………………….. 89
3-13- بررسي تغييرات سيتوپلاسمي سلول هاي سرطاني بعد از انجام تست MTT ………………… 97
فصل چهارم بحث و پيشنهادات ………………………………………………………………………. 98
منابع …………………………………………………………………………………………………………………………….. 108
چکيده
ال- آسپاراژيناز آنزيمي است که موجب هيدروليز آسپاراژين به اسيد آسپاراتيک و آمونياک مي شود . نام ديگر آن ال-آسپار است . اين آنزيم امروزه جهت درمان بيماري سرطان خون و برخي تومور ها استفاده مي شود. بطور کلي سلولهاي سرطاني قادر به سنتز اسيد آمينه غير ضروري آسپاراژين نيستند در حالي که سلولهاي نرمال خودشان اين اسيد آمينه را مي سازند لذا سلولهاي سرطاني نيازمند به مقادير بالا از آسپاراژين در حال گردش مي باشند . ال- آسپاراژيناز با تجزي? ال-آسپاراژين مانع از دسترسي سلولهاي سرطاني به منابع اين اسيدآمينه مي شود . مهمترين اثر جانبي اين دارو حالت آلرژي يا واکنش افزايش حساسيت است . هدف ما از اين تحقيق 1- تهيه پروتئين آنزيم ال-آسپاراژيناز از باکتري جهش يافته E. coli . 2- تاثير اين پروتئين بر روي يک رده سلولي سرطاني به منظور ارزيابي فعاليت آن و 3- دستيابي به آنزيم ال-آسپاراژيناز موثرتر ، با کارايي بالا و عوارض جانبي کمتر بوده است. لذا به منظور رسيدن به اهداف فوق مراحل آزمايشگاهي زير انجام شد: 1- قرار دادن باکتري E. coli در معرض نور UV . 2- تخليص DNA و انجام PCR به منظور تکثير ژن آنزيم. 3- قرار دادن سکانس در داخل پلاسميد pET23a(+) و انتقال به E. coli. 4- خالص سازي پروتئين و تعيين مقدار آن. 5- تاثير بر روي يک لاين سرطاني و تعيين مقدار تاثير آن. به اين ترتيب بعد از ايجاد جهش و سنجش ميزان توليد و فعاليت آنزيم ال-آسپاراژيناز در کلني هاي جهش يافته و تخليص و تکثير ژن اين آنزيم از باکتري هايي که ال-آسپار را بيش از حد معمول توليد مي کردند، محصول PCR اين ژن ها براي تعيين توالي ارسال گرديد و پس از تعيين توالي و مطابقت با بانک ژن بين المللي ncbi ، سکانس قطعه ژني ال-آسپاراژيناز II از باکتري E. coli KIAU B1 به عنوان يک سکانس جديد در بانک ژن با کدGenBank: HQ116626.1 به ثبت رسيد. ژن مذکور در وکتورpET23a(+) کلون و سپس پلاسميد نوترکيب حاصل در سلول هاي E. coli BL21 ترانسفر شد. . از سلول هاي ترانسفر شده ،پروتئين نوترکيب ال-آسپاراژيناز استخراج شد و پس از سنجش اين پروتئين آنزيمي با تست هاي نسلريزاسيون و برادفورد، ميزان فعاليت آنزيمي(IU) و پروتئين کلّي(mg) آن مشخص و با نمون? استاندارد مقايسه شد. همچنين از نظر تأثير بر سلول هاي سرطاني HeLa و LCL ، با نوع استاندارد قياس شد. نتايج نشان داد که فعاليت ويژه ال-آسپاراژيناز نوترکيب برابر باIU/mg 178 مي باشد، در حالي که فعاليت ويژه ال-آسپاراژيناز استانداردIU/mgr 77 به دست آمد. همچنين، آنزيم نوترکيب علاوه بر آن که از نظر سکانس و قدرت آنزيمي با نوع استاندارد تفاوت نشان مي دهد ، نسبت به آن به نحو موثرتري بر رده هاي سلولي سرطاني HeLa و LCL تاثير مي گذارد.

مقدمه
با توجه به شيوع روز افزون انواع سرطان به عنوان يکي از مهمترين بيماري هاي تهديد کنند? سلامت انسان، دستيابي به روش هاي موثرتر در درمان سرطان به ويژه انتخاب ترکيبات دارويي با عوارض جانبي کمتر بيش از گذشته مورد توجه محققين قرار گرفته است.
آنزيم ال-آسپاراژيناز به صورت اختصاصي اسيدآمينه ال-آسپاراژين را به ال-آسپارتات و آمونياک کاتاليز کرده و نقش مهمي را در متابوليسم همه ارگانيسم هاي زنده و نيز در داروشناسي بازي مي کند(2). دو نوع ترکيب از ال-آسپاراژيناز وجود دارد : ال-آسپاراژيناز l، يک آنزيمconstitutive داخلي، و ال-آسپاراژيناز ll، يک آنزيم خارجي مي باشد. اين دو آنزيم از لحاظ بيوشيميايي و ساختار ژنتيکي متفاوتند. ال-آسپاراژيناز ll به صورت گسترده در سلول هاي پروکاريوتي و يوکاريوتي وجود دارد و بيش از پنج دهه مورد مطالعه فراوان قرار گرفته است(66). اين آنزيم از منابع گوناگون مانند سلول هاي گياهي و حيواني، قارچ ها، مخمرها و باکتري ها جدا شده است(61).
ال-آسپاراژينازll يک عامل شيمي درماني مهم مي باشد که براي درمان نوعي از اختلالات لنفوپروليفراتيو و لنفوما، به ويژه لوکمي لنفوبلاستيک حاد يا ALL1 بکار برده مي شود. اين آنزيم بخش اصلي ترکيب پروتوکل هاي شيمي درماني است که در درمان ALL اطفال به مدت تقريباً 30 سال استفاده مي شود (6،5،4،3،2،1). بر اين اساس، همچنين اين آنزيم در جديدترين رژيم هاي درماني چند عاملي براي ALL بالغين قرار دارد (8،7). ال-آسپاراژيناز به عنوان يک دارو، اثربخشي خود را در درمان و مراحل بعدي استراتژي هاي مختلف شيمي درماني اثبات کرده است. بزرگ ترين محدوديت استفاده از ال-آسپاراژيناز حساسيت شديد باليني در دز اثر بخشي است، که در 78-3 درصد بيماران تحت درمان با فرم هاي اصلاح نشده آنزيم ظاهر مي شود (11،10،9،3). با گذشت بيش از 10 سال به نظر مي رسد پگ-ال-آسپاراژيناز به عنوان يک ترکيب جانشين براي ال-آسپاراژيناز ، مشکلات ناشي از انواع ترکيبات طبيعي را اصلاح کرده است (13،12). در اين تحقيق سعي بر اين شد تا با ايجاد جهش در باکتريKIAU E. coli ، ارزيابي ميزان توليد آنزيم ال-آسپاراژينازll در سويه جهش يافته، و دستيابي به ترتيب توالي جديد در ژن اين آنزيم و کلون کردن آن، بتوان ال-آسپاراژينازي استخراج کرد که از نظر فعاليت ويژه و اختصاصيت در سطح بالاتري نسبت به نوع استاندارد قرار داشته باشد. همچنين با تاثير اين پروتئين آنزيمي بر رده سلولي سرطاني و ارزيابي فعاليت و درصد کشندگي آن بر اين سلول ها، بتوان به آنزيم ال-آسپاراژيناز موثرتر، با کارايي بالا و عوارض جانبي کمتر دست يافت.
فصل اول
کليات
1-1-پيشينه تاريخي
نظريه اوليه که به منظور گسترش ال-آسپاراژيناز به عنوان يک عامل بالقوه آنتي نئوپلاستيک ثابت شد بسيار با اهميت بوده و توسط Clementi در سال 1922 طرح شد(20). وي آشکار ساخت که فعاليت بالاي ال-آسپاراژيناز در سرم خوکچه هندي ديده مي شود. فعاليت بالاي ال-آسپاراژيناز فقط در سرم خوکچه هندي مشاهده مي شد، درحاليکه در ساير پستانداران اين آنزيم يافت نمي شد. در سال 1953، Kidd عود لنفوماهاي پيوندي در موش ها و رت ها را با خوکچه هندي مقايسه کرد و شرح داد(39). اين فعاليت سايتوتوکسيک در سرم اسب يا خرگوش وجود نداشت. Neuman و McCoy در سال 1956 اين نظريه ها را گسترش دادند(45). آنها ثابت کردند که رشد لاين سلولي که از کارسينوسارکوماي Walker مشتق شده مستلزم ال-آسپاراژين است. Haley در سال 1961 با استفاده از لاين سلولي مربوط به لوکمي موش نتايج مشابهي بدست آورد (29). و بالاخره Broome بود که در سال 1961 درحاليکه در آزمايشگاه Kidd کار مي کرد ، يافته هاي Kidd مربوط به مهار رشد را با اولين نظريه که توسط Clementi ارائه شد مقايسه کرد و با موفقيت نتيجه گرفت که فعاليت آنتي لنفوما در سرم هاي خوکچه هاي هندي ناشي از ال-آسپاراژيناز موجود در سرم اين حيوان مي باشد (12). تحقيقات بيشتر اين شخص خصوصيت نهفته درماني اين آنزيم را تاييد کرد (12،11). Yellin وWriston در سال 1966، موفق به خالص سازي جزئي دو ايزوفرم ال-آسپاراژيناز از سرم خوکچه هندي شدند (63). بطور قابل توجه ، فقط يک ايزوفرم در شرايط in vivo فعاليت آنتي لنفوما را آشکار مي ساخت (64،63) .
از آنجاييکه استخراج اين آنزيم به مقادير کافي از سرم خوکچه هندي مشکل بود ، ساير منابع نظير ميکروبها بررسي شدند. Mashburn و Wriston ، در سال 1964 و Campbell و Mashburn در سال 1969 از خالص سازي ال-آسپاراژيناز E. coli خبر دادند، و ثابت کردند که فعاليت تومورکشي آن شبيه به نوع سرمي خوکچه هندي مي باشد(64،15). اين يافته ها پايه عملي توليد آنزيم با مقادير زياد را براي تحقيقات باليني و پيش باليني فراهم کرد(17،16،15) . Oettgen در سال 1967 اولين کسي بود که تأثير ال-آسپاراژيناز در انسان هاي مبتلا به لوکمي را نشان داد (46). بطور همزمان بررسي مهم ديگري توسط Old انجام شد که فعاليت آنتي توموري اين آنزيم را در شرايط in vivo در يک مدل سگي مبتلا به لنفوسارکوما اثبات مي کرد(47).
درمان با استفاده از پروتئين ها در انسان ها محدوديت دارد زيرا منجر به ايمني زايي دارو مي شود که مشکلي اساسي مي باشد. واکنش هاي حساسيت شديد نسبت به ال-آسپاراژيناز E. coli بطور متوسط عموميت دارد. يک بررسي هم زمان بر روي ال-آسپاراژيناز E. coli و Erwinia carotovora فقدان واکنش تقاطعي را نشان مي دهد (24). هرچند هردو آنزيم به ميزان زيادي سبب تحريک سيستم ايمني مي گردند. تلاش ها در اين زمينه موجب کاهش ايمني زايي اين دارو ها شده است و اين در حاليست که فعاليت آنزيمي آن حفظ شده است. مشخص شده است اتصال اين آنزيم به پلي اتيلن گلايکل يا PEG2 به عنوان يک پردازش، واکنش هاي ايمني زايي اين دارو را از بين مي برد بدون آنکه در ويژگي آنتي نئوپلاستيک آن تغيير ايجاد کند(27). اين ترکيب اصلاح شده دارو در مدل هاي حيواني باعث کاهش تشکيل آنتي بادي در مقايسه با ترکيب بومي آن مي شود، و بطور محسوس مدت اثرش را طولاني مي کند(57،27). در سال هاي اخير، استفاده از ال-آسپاراژيناز در درمان لوکمي و ساير اختلالات لنفوپروليفراتيو بطور وسيع افزايش يافته است. در اوايل از آن تنها براي بهبود بيماران مبتلا به ALL استفاده مي شد (36،35،34،33،32،31،30،2،1)؛ اما پس از تحقيقات اخير به منظور تقويت درمان بدخيمي هاي لنفوئيد، عملکرد اين آنزيم را به مدت 30-20 هفته تجويز مي گردد(57) . به اين دلايل است که ال-آسپاراژيناز به عنوان يک جزء ضروري در روش هاي نوين شيمي درماني چند دارويي قرار گرفته است.
1-2-آماده سازي ال-آسپاراژيناز قابل استفاده براي درمان
تحقيقات اوليه با نتايج مثبت با استفاده از ال-آسپاراژيناز خوکچه هندي انجام شد، اما ثابت شد که آماده سازي حجم انبوه از اين آنزيم ميسر نمي باشد. اگرچه ال-آسپاراژيناز در گونه هاي مختلف گياهي و حيواني يافت شده است، اما به دليل روش سخت استخراج اين آنزيم، ساير منابع نظير ميکروارگانيزم ها نيز بررسي شدند. ميکروارگانيزم ها ثابت کردند که براي توليد اين آنزيم منابعي مؤثرتر و ارزان تر هستند. سهولت کشت آنها به توليد فراوان اين آنزيم کمک مي کند. دامنه وسيعي از ميکروب ها شامل باکتري ها ، قارچ ها ، مخمرها ، اکتينومايست ها و جلبک ها از نظر توليد اين آنزيم مؤثرترند، اما خصوصيات آنزيمي از ارگانيسمي به ارگانيسم ديگر تغيير مي کند ( جدول 1 ). براي توليد مقادير بالاي اين آنزيم فقط از دو گونه باکتري استفاده مي شود 1-. E. coli و2- Erwinia caratovora . مشخص شده که در بين تنوع وسيع آنزيم هاي مشابه با فعاليت آنتي توموري شناخته شده، آنزيم اين دو منبع سميت کمتري دارد (24،8،7،6،5،4،3،2،1) .

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

امروزه، ال-آسپاراژيناز مورد استفاده در بيمارستان با سه نوع ترکيب در دسترس مي باشد: دو فرم تغيير نيافته يا فرم هاي طبيعي، خالص شده از منابع باکتريايي، و يک فرم اصلاح شده از يکي از ترکيبات طبيعي. ترکيبات طبيعي E. coli (از نظر تجاري توسط Merck & Co به عنوان Elsperعرضه مي شود)، و Erwinia caratovora (قابل استفاده به عنوان ال-آسپاراژيناز Erwinia از Ogden Bioservices Pharmaceutical Repository در ايالات متحده) مي باشند. محصول Erwinia از نظر تجاري در کانادا و اروپا به عنوان ارويناز3 در دسترس است، که توسط Porton عرضه مي شود.

جدول 1: خصوصيات برخي از ال-آسپاراژينازهاي ميکروبي. (52)
Specific activity (purified enzyme, IU/mg)Km (M)Temperature optimapH optimaMicrobial source1671.8 × 10- 5508.0Erwinia carotovora1624.4 × 10 -6377.2Pseudomonas 7A20202.5 × 10 -3407.0Corynebacterium glutamicum5.61.7 × 10 -5378.5Vibrio succinogenes-2.4 × 10 -4378.0Bacillus sp.-5.8 × 10 -440-455-7Aspergillus terreus7321.4 × 10 -4379.0Pseudomonas stutzeri
هردو ترکيب طبيعي از نظر استفاده براي درمان بيماران رديف اول و دچار عود بيماري، تأييد شدند. در اروپا، دو ترکيب از ال-آسپاراژيناز E. coli با تفاوت مختصر در خصوصيات فارماکوکنتيک، بنام هاي کراسنيتين و ال-آسپاراژينازMedac در دسترس مي باشد (11) . اين آنزيم ها به عنوان يک دارو از دو منبع، مکانيزم عمل و سميت يکساني دارند، اگرچه خصوصيات فارماکوکنتيک آن دو متفاوت است، و بيماراني که داراي حساسيت شديد به يکي از دو ترکيب هستند اغلب مي توانند ال-آسپاراژيناز ديگر را استفاده کنند بدون اينکه با عامل دوم آلرژي ايجاد شود.
سومين ترکيب، پگ-ال-آسپاراژيناز4 ( نام غير اختصاصيpegasparaginase )، يک ترکيب از آنزيم مي باشد که بطور شيميايي تغيير داده شده است. درواقع ال-آسپاراژيناز بومي E. coli به صورت کووالانسي به PEG متصل مي شود. پگ-ال-آسپاراژيناز، که اکنون به عنوان pegasparaginase يا pegasparagase ارجاء داده مي شود، در سال هاي 1970 و 1980 گسترش يافته و در 1980 تحت کنترل آزمايشات باليني قرار گرفته بود. Pegasparaginase ( در دسترس به صورت تجاري توسط Rhone Poulenc Rorer به عنوان Oncaspar ) توسط وزارتخانه غذا و دارو تأييد شد تا در ترکيب شيمي درماني به منظور درمان بيماران ALL ، کساني که به ترکيب طبيعي ال-آسپاراژيناز E. coli حساسيت شديد دارند، قرار گيرد.

1-3- آزمايش هاي باليني با ال-آسپاراژيناز
در 30 سال اخير اطلاعات آماري مربوط به آزمايشات باليني در مورد ال-آسپاراژينازهاي طبيعي Erwinia و E. coli در موارد بسيار و به وفور مورد بحث قرار گرفته است. به دليل آنکه حساسيت شديد با ترکيبات طبيعي مرتبط است، به نظر مي رسد، ترکيبات اصلاح شده دارو بيش از پيش در کاربرد هاي باليني اهميت يافته باشند. آنزيم پگيليشن شده نسبت به هريک از دو ترکيب طبيعي قابل استفاده، اکنون بيشتر استفاده مي شود زيرا مشخص شده است که استعمال آنها در بيشتر بيماران داراي آلرژي به ال-آسپاراژينازهاي Erwinia و E.coli بي خطر است. همچنين اين آنزيم در پلاسما به مدت طولاني تر باقي مي ماند که اين ويژگي نياز به تجويز مکرر دارو را برطرف مي کند(59،58،57،56،27).
Ho و همکاران در تحقيق بر روي افزايش تدريجي در فاز I دارويي، Pegaspargase را از طريق وريدي ( محدوده دز از 5000 تا IU/m2 8000 ) و هر دو هفته به مدت 1 ساعت به 31 بيمار بالغ تزريق کردند(31). فقط سه بيمار علائم سميت را به شکل واکنش هاي آنافيلاکتيک ظاهر کردند. افزايش گلوکز خون5 و اختلال کبدي از ديگر اثرات سمي مشاهده شده بود. نتيجه اين بررسي در هيچ جا به ارتباط مقدار دز دارو و سميت اشاره اي نکرد. واکنش ها در بيماران مبتلا به ALL و لنفوما مشاهده شدند. اين بررسي، پايه آزمايش هاي بعدي را تشکيل داد که محدوده يکساني از دزها بين IU/m2 2500 – 2000 را براي تحقيقات باليني انتخاب مي کرد.
مغاير با اکثر تحقيقاتي که به دنبال تجربه فاز I آزمايش باليني Ho و همکارانش انجام شد، Vieira Pinheiro و سايرين توانستند فعاليت ال-آسپاراژيناز سرم ( U/I 100< ) را در سطح يکنواخت حفظ کنند(60)؛ که اين امر براي کاهش ضروري ال-آسپاراژين بسيار رضايتبخش بود. آنها U/m2 500 ازPEG-L-asparaginase (OncasparTM) را به کودکان دچار عود ALL تزريق کردند. اکثر بيماران به مدت حداقل يک هفته به بررسي دزهاي پايين اين دارو پاسخ خوبي دادند. گروه ديگر فاز I آزمايش باليني و ارزيابي فارماکوديناميک pegaspargase را در بيماراني انجام دادند که داراي تومورهاي سخت پيشرفته بودند. بيماران هر دو هفته يکبار تحت تأثير دزهاي 250، 500، 1000، 1500 و U/m2 2000 از pegaspargase قرار مي گرفتند، که در اکثر موارد به مدت 14 روز در حفظ سطح پايين ال-آسپاراژين موفق بودند. واکنش هاي درجه 1 و 2 حساسيت شديد اغلب بعنوان سميت هاي ايمونوژنيک در دز U/m2 2000 گزارش شدند(59).
1-4-خصوصيات شيميايي و داروشناسي اين دارو
1-4-1 اثر ضد سرطاني
سلول هاي توموري، مخصوصاً سلول هاي لنفاوي، به مقدار زيادي آسپاراژين نياز دارند تا بتوانند رشد سريع بدخيمي شان را حفظ کنند. اين به آن معنا است که آنها علاوه بر استفاده از آسپاراژيني که خودشان مي سازند ( که محدود است ) از آسپاراژين رژيم غذايي ( سرم خون ) نيز استفاده مي کنند تا نياز فراوان شان به ال-آسپاراژين را تأمين کنند. ال-آسپاراژيناز به عنوان يک دارو، اين نياز زياد و غيرمعمول سلول هاي توموري نسبت به آمينواسيد ال-آسپاراژين را هدف قرار مي دهد. ال-آسپاراژيناز هيدروليز ال-آسپاراژين به ال-آسپارتيک اسيد و آمونياک را کاتاليز مي کند ( شکل. 1 ). لنفوبلاست هاي مبتلا به لوکمي و برخي ديگر از سلول هاي توموري که فاقد ال-آسپاراژين سينتتاز هستند و يا سطوح بسيار پايين از اين آنزيم را دارند، توانايي سنتز ال-آسپاراژين به صورت de novo را ندارند و بنابراين براي تکثير و بقاء خود به آسپاراژين موجود در سرم تکيه دارند(41،40). ال-آسپاراژيناز باعث کاهش آسپاراژين سرم مي شود و سلول هاي توموري را از طريق محروم ساختن آنها از يک فاکتور ضروري مورد نياز براي سنتز پروتئين، از بين مي برد. اما سلول هاي سالم تحت تأثير قرار نمي گيرند، چنانچه آنها قادرند خودشان با کمک آنزيم ال-آسپاراژين سينتتاز، که به مقدار کافي موجود است، آسپاراژين را سنتز کنند. Asselin و سايرين مرگ سلولي را در هردو شرايط in vitro و in vivo در بيماران مبتلا به ALL تحت درمان با ال-آسپاراژيناز به عنوان يک عامل واحد، تشخيص دادند(9). ممانعت از چرخه سلولي در مرحله G1 در لاين سلولي L5178Y موش و لاين T -لنفوبلاستوئيد MOLT-4 انساني گزارش شده که منجر به آپوپتوزيس شده است(55،54). يک لاين سلول لوکمي لنفوبلاستيک حاد انساني بطور قابل توجهي توسط آسپاراژينازها متوقف شد، که اثر آن 10 برابر بيشتر از ال-آسپاراژيناز Erwinia caratovora مي باشد (52).
طبق آزمايشاتي که روي لاين هاي سلولي لوکمي مغز استخوان انجام شده، ال-آسپاراژيناز براي ايجاد آپوپتوزيس، به پروتئين p53 قارچي نياز دارد(28). هرچند، يافته ديگري شديداً اين تفکر متداول را رد مي کند که مزيت درماني ال-آسپاراژيناز در لوکمي، براساس انجام مقايسه بين سلول هاي لوکمي فاقد آسپاراژين سينتتاز کافي با سلول هاي عادي مي باشد (3).
شکل.1. مثال شماتيک از مکانيسم عمل ال-آسپاراژيناز
1-4-2- ترکيبات شيميايي داروي در دسترس براي درمان

1-4-2-1 آنزيم طبيعي
ايزوآنزيم هاي مختلف ال-آسپاراژيناز با استفاده از گونه هاي متفاوت E. coli جدا شده اند(33) . ال-آسپاراژيناز خالص شده E. coli داراي وزن مولکولي 141-133 کيلودالتن مي باشد (42،35). بديهي است که همه آسپارژينازها از چهار زيرواحد تشکيل شده اند که در هر زيرواحد يک جايگاه فعال قرار گرفته و وزن مولکولي هر زيرواحد 22 کيلودالتن گزارش شده است(62) . بررسي هاي Ehrman و سايرين اشاره مي کند به اينکه وزن مولکولي هر زيرواحد در ال-آسپاراژيناز E. coli در حدود 32 کيلودالتن و بنظر مي رسد در ترکيبات آماده سازي شده Erwinia در حدود 40 کيلودالتن باشد(25).
جدول 2: فعاليت گلوتاميناز آسپاراژينازهاي مختلف. (63)
Glutaminase activity (%)Specific activity (U/g)Source050Guinea pig serum2270E. coli10700Erwinia560Serratia
مشخص شده که وزن مولکولي ال-آسپاراژيناز Erwinia 138 کيلودالتن مي باشد. فعاليت ويژه آنزيم خالص شده مابين 300 و 400 ميکرومول از سوبسترا در هر دقيقه و در هر ميلي گرم از پروتئين است. دامنه تغييرات نقطه ايزوالکتريک براي آنزيم E. coli بين 5/5 و 6/4 pH ، و براي آنزيم Erwinia در حدود 7/8 مي باشد (30) . Km براي ال-آسپاراژيناز تقريباً mol/l5-10 × 1 است (58) . معلوم شده که اين آنزيم هاي ال-آسپاراژيناز داراي حداکثر %10 فعاليت ال-گلوتاميناز هستند ( جدول 2 )(63). با توجه به اينکه تمام روش هاي خالص سازي براي از بين بردن اين فعاليت گلوتامينازي تاکنون ناموفق بوده است و حتي ال-آسپاراژيناز نوترکيب فعاليت ال-گلوتاميناز را از خود نشان مي دهد، بنابراين هيدروليز ال-گلوتامين با واسطه آلوده بودن آنزيم ال آسپاراژيناز با يک آنزيم ديگر انجام نمي شود بلکه توسط خود ال-آسپاراژيناز که داراي فعاليت ال-گلوتامينازي مي باشد، انجام مي شود (30). ال-آسپاراژيناز خوکچه هندي فعاليت گلوتاميناز ندارد ( جدول 2 ) اما هيچگاه در مقادير کافي براي آزمايشات باليني در دسترس نبوده است. در مورد خالص سازي و خصوصيات آنزيم هاي Erwinia و E. coli بطور گسترده تجديد نظر و انتقاد شده، و برخي ترکيبات طبيعي و تغييريافته در جدول 3 بطور خلاصه آورده شده اند (62،17).
جدول 3 : مقايس? ال-آسپاراژينازهاي بومي و اصلاح شده
Erwinia (Native) E. coli
Native PEGylated650-700280-400 280-400Activity (IU/mg protein)1212 12Km (µM)-l-asparaginase14003000 3000Km (µM)-l-glutaminase0.100.03 0.03l-Glu/l-Asp (maximal activity)138000141000 _Molecular weight8.75.0 5.0PI
1-4-2-2-آنزيم تغييريافته ( اصلاح شده )
تحريک سيستم ايمني نسبت به پروتئين خارجي تقريباً در %25 از بيماران بصورت واکنش هاي ضعيف آلرژيک تا شوک هاي آنافيلاکتيک بروز مي کند(56)، و نيمه عمر بسيار کوتاه، درمان بعدي با ال-آسپاراژيناز طبيعي را محدود مي کند. به منظور اجتناب از تزريقات مکرر درون عضلاني، تلاش هاي بسياري براي کاستن از تحريک سيستم ايمني، انجام شده است، يعني در عين آن که عملکرد آنزيم حفظ شود ، مدت نيمه عمرش نيز افزايش يابد. تغييرات شيميايي توانسته تاحدي اين نيازها را برآورده سازد. در اين خصوص، در اواسط 1970 ، چندين گروه با در اختيار گرفتن روش هاي مختلف مبادرت به ايجاد تغييرات شيميايي در ال-آسپاراژيناز کردند تا بتوانند در اين آزمايشات، ترکيبي را تهيه کنند که کمتر تحريک کننده سيستم ايمني باشد و در عين حال فعاليت مفيد آنتي توموري را حفظ کرده باشد(56،8). ايجاد چنين ترکيبي فقط با اين روش ها ممکن بود ؛ که بتوانند اپي توپ هاي فعال از نظر تحريک سيستم ايمني را بپوشانند بدون اينکه ويژگي ضدسرطاني اين دارو به خطر افتد.
پگيليشن6، يا اتصال ال-آسپاراژيناز به PEG به عنوان موفق ترين روش تغيير7 شيميايي به اثبات رسيد. اين روش در 1970 و 1980 گسترش يافت. Abuchowski و همکارانش اولين گروهي بودند که بطور موفقيت آميز PEG را به ال-آسپاراژيناز متصل کردند. فعاليت هاي آنتي لوکمي اين ترکيب جديد در تومور L5178Y وابسته به مدل موشي BDF آزمايش شد. اتصال آنزيم به PEG در از ميان بردن تحريک سيستم ايمني اين دارو نتيجه بخش بود(65). بطور قابل توجه ، خصوصيات بيوشيميايي PEG-L-asparaginase ، که با نام تجاري pegasparagase عرضه مي گردد، با آنزيم طبيعي تفاوت دارد. وزن مولکولي ثابت آن زياد است و واکنش پذيري آن با آنتي بادي هاي خاص بسيار کم است، اما اگر دارو بطور متناوب در معرض يخ زدگي- آب شدگي8 قرار گيرد، اين واکنش پذيري افزايش مي يابد. بررسي هاي باليني نشان مي دهد که آنزيم هم در مدل هاي حيواني و هم انساني فعاليت آنتي توموري دارد(65). ايمني زايي کاهش يافته در شرايط in vivo در کودکان حساس به عودهاي متعدد ALL تأييد شده است(65). Ettinger و سايرين در 1994، فقدان آنافيلاکسي ،کاهش تکرار افزايش قند خون و التهاب پانکراس را در مدت درمان با پلي اتيلن گلايکل-ال-آسپاراژيناز، گزارش دادند(27). ترکيبات در دسترس براي درمان، از نظر علمي با نام pegaspargase شناخته مي شوند؛ و ONCASPAR نام تجاري آن مي باشد و کارخانه توليدکننده آن، ENZON ، South Plainfield ، NJ مي باشد. خلاصه نتايج خصوصيات شيميايي پروتئين در جدول 3 آورده شده.
تعداد بسيار زيادي از روش هاي اصلاح و بهسازي شيميايي، با وجود داشتن برخي اشکالات، آزمايش شدند. همچنين اتصال ال-آسپاراژيناز به دکستران به منظور ايجاد تغيير در پايداري ويژگي پروتئوليتيک و حرارتي و به منظور کاهش تحريک سيستم ايمني آزمايش شد (53). اما بعد از آن اثبات شد که از لحاظ ايجاد کاهش در سميت تحريک سيستم ايمني نسبت به PEG اثربخشي کمتري دارد. Uren وRagin در 1979 از پپتيدهاي پلي-دي ال-آلانيل براي بلوک کردن اپي توپ هاي ايمني زاي ال-آسپاراژيناز E. coli و Erwinia استفاده کردند (56)؛ اما بررسي هاي باليني در اين زمينه تاکنون انجام نشده است. Nerker و Gangadharan در 1989 ال-آسپاراژيناز Erwinia را با آلبومين سرم انساني ترکيب کردند. در اين مورد هنوز بررسي هاي in vivo در انتظار انجام است. همچنين اتصال گروه آسيل نيز به عنوان يک روش براي بهسازي ال-آسپاراژيناز بکار برده شد (43). اما محدوديت اين روش، هيدروفوب شدن آنزيم بعد از اين تغيير است. ال-آسپاراژيناز محصور شده در سلول هاي قرمز خون کاملاً پايدار و بطور مشخص داراي نيمه عمر طولاني در in vivo بود (32،21). تزريق درون وريدي در موش منتج به حذف کامل ال-آسپاراژيناز به مدت 2 هفته شد، هرچند به نظر مي رسد تحريک سيستم ايمني توسط آنزيم، فقط به مقدار اندک کاهش يافته باشد(37). همچنين ال-آسپاراژيناز پالميتويل9، مشتق ديگري از آنزيم است که تغيير شيميايي پيدا کرده، در ليپوزوم قرار داده شده و در جانوران آزمايش شده است(35)؛ اين آنزيم حدوداً 10 برابر تمديد نيمه عمر دارد بدون اينکه سميت حاد داشته باشد.
از طريق روش جهش زايي مستقيم جايگاه در ژن، حذف اپي توپ هاي غالب تحريک کنند? سيستم ايمني از آنزيم ال-آسپاراژيناز باکتري Erwinia chrysanthemi بررسي شد(53)؛ اين کار با استفاده از هگزاپپتيد سنتتيک و آنتي سرم هاي پلي کلونال خرگوش ها و موش ها انجام شد؛ که نتيجه آن کاهش تدريجي و قابل توجه در اتصال آنتي بادي ها و کاهش تحريک سيستم ايمني بدون تغيير در عملکرد آنزيم بود. اين آنزيم در E. coli بيان شد. Harry و همکارانش در سال 1986 ال-آسپاراژيناز Erwinia chrysanthemi را در E. coli و Erwinia caratovora کلون و بيان کردند؛ که بيان زياد و 3 برابري اين محصول را نشان داد.
1-5- فارماکوکنتيک10
فارماکوکنتيک هر دارو بسيار وابسته به مسير توزيع آن است، ممکن است به صورت درون وريدي11 يا درون عضلاني12 باشد. همچنين Schwartz و همکارانش نشان دادند که فارماکوکنتيک دارو علاوه بر مسير توزيع، به نوع ترکيب مورد استفاده نيز بستگي دارد ( جدول 4 )(10). بررسي هاي in vivo ، روشن ساخته است که نيمه عمر ال-آسپاراژيناز E. coli و Erwinia مشابه هم و به مدت 10 ساعت است. يافته هاي نسبي از خصوصيات فارماکوکنتيک ال-آسپاراژينازهاي مختلف، بطور خلاصه در جدول 4 آورده شده است.
اکنون مشخص شده است که ال-آسپاراژيناز بعد از القاء و توزيع در بدن، در محدوده فضاي عروقي باقي مي ماند. اين حالت در مايعات پرده اطراف ريه13 و مايعات شکمي14 نيز يافت شده است (49)، اما در مايع مغزي نخاعي مشخص نشده است(13). Schwartz و همکارانش دريافتند که حتي بعد از القاء داخل وريدي (I.V.) U/kg 5000 وزن بدن، فقط مقدار کمي از ال-آسپاراژيناز در مايع مغزي نخاعي قابل تشخيص است. هنگاميکه آنزيم مستقيماً در مايع مغزي نخاعي تزريق مي شود، فوراً به پلاسما انتقال مي يابد. محققين مختلف گزارش دادند که بعد از درمان با ال-آسپاراژيناز، سطوح ال-آسپاراژين در مايع مغزي نخاعي کاهش مي يابد(64،63،62،61،60،59،58). يک گزارش از لوکمي مربوط به مننژ وجود دارد که بطور موفقيت آميز با ال-آسپاراژيناز درمان شده است(46). چند تن از محققين نشان داده اند، بيماراني که نسبت به ترکيب ال-آسپاراژيناز طبيعي حساسيت شديد دارند کاهش نيمه عمر آنزيم در آنها ديده مي شود(40،31،17).
جدول4: جزئيات فارماکوکنتيک ال-آسپاراژينازهاي مختلف.(9,10)
Depletion period
of l-asparaginase
(days)T/2 (days)Dosage
(IU/m2)l-Asparaginase


پاسخ دهید