3- 2- 5- ملاحظات اخلاقي29
3- 2- 6- مشکلات و محدوديت ها29
3- 2 – 7- جمع آوري اطلاعات بيماران29
3- 3- انجام امور باکتريولوژيک29
3- 3 – 1-کشت، جداسازي و تعيين هويت باکتريها29
3- 3 – 2-بررسي حساسيت آنتي بيوتيکي30
3- 3 – 3- روش تعيين حساسيت باکتري ها نسبت به آنتي بيوتيک30
3- 3 -3- 1-تهيه ي محيط کشت30
3- 3 -3- 2-تهيه ي سوسپانسيون ميکروبي30
3- 3 -3- 3-مرحله ديسک گذاري31
3- 4- انجام آزمايشات مولکولي31
3- 4 – 1- استخراجDNA باکتري31
3- 4 – 1- 1-کشت31

3- 4 – 1- 2- جداسازي رسوب باکتري31
3- 4 – 1- 3- نگه داري DNA استخراج شده32
3- 4 – 1- 4- اندازه گيري مقدار DNA استخراج شده33
3- 4 – 2- پرايمر هاي مورد استفاده جهت شناسايي ژنهاي gyrA33
3 -4-2-1- طراحي و سنتز پرايمر و بررسي کيفيت پرايمر ها33
3-4-3- PCR34
3-4-3-1-گراديانت دمايي جهت بدست آوردن دماي اتصال34
3-4-3-1- بررسي جهش اي احتمالي بر روي ژن gyrA با استفاده ازPCR-RFLP پرايمر (L وD)38
3-4-4- الکتروفورز39
3-4-4-1- الکتروفورز محصول PCR39
3-4-4-2- رنگ آميزي ژل و عکس برداري39
3-4-5- ترادف يابي40
فصل چهارم:نتايج تحقيق
4- 1- نتايج کشت جداسازي و تعيين هويت باکتري ها و اطلاعات مربوط به بيماران41
4-2- فراواني بيماران بر اساس سن و سال و جنس42
4-3- نتايج مربوط به توزيع سرو گروه هاي شيگلا43
4-4- نتايج مربوط به حساسيت آنتي بيوتيکي44
4-5- نتايج آزمون PCR براي شناسايي ژنgyrA در سويه هاي مقاوم نسبت به ناليديکسيک اسيد46
4-6- انجام آزمون روي ساير ايزوله ها توسط Primer L48
4-7- بررسي جهش هاي احتمالي بر روي ژن gyrA با استفاده از PCR-RFLP52
4-8- انجام آزمون روي ساير ايزوله ها توسط Primer D57
4-9- بررسي جهش هاي احتمالي بر روي ژن gyrA با استفاده از PCR-RFLP61
4 – 10- نتايج مربوط به بررسي وجود ژنهاي qnrA، qnrB، qnrS در نمونه هاي باليني شيگلا65
4 – 11- نتايج تعين توالي68
فصل پنجم:بحث و نتيجه گيري
5-1 بحث و نتيجه‌گيري74
منابع فارسي و لاتين82
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 3-1 مشخصات پرايمر هاي مورد استفاده در شناسايي ژن gyrA34
جدول 3-2 پرايمر هاي مورد استفاده جهت شناسايي ژن هاي qnrS 34
جدول 3-3 پرايمر هاي مورد استفاده جهت شناسايي ژنهاي qnrA 34
جدول 3-4 پرايمر هاي مورد استفاده جهت شناسايي ژنهاي qnrB 34
جدول 3-5 مقادير و ترکيبات مورد استفاده براي يک واکنش PCR براي ژن gyrA پرايمر ( L )35
جدول 3-6 شرايط دمايي اوليه مورد استفاده براي يک واکنش PCR براي gyrA پرايمر ( L )35
جدول 3-7 مقادير و ترکيبات مورد استفاده براي يک واکنش PCR براي ژن gyrA پرايمر ( D ) 35
جدول 3-8 شرايط دمايي اوليه مورد استفاده براي يک واکنش PCR براي gyrA پرايمر ( D )36
جدول 3-9 مقادير و ترکيبات مورد استفاده براي يک واکنش PCR جهت شناسايي qnrS36
جدول 3-10 شرايط دمايي اوليه مورد استفاده براي يک واکنش PCR جهت شناسايي qnrS36
جدول 3-11 مقادير و ترکيبات مورد استفاده براي يک واکنش PCR جهت شناسايي qnrA 37
جدول 3-12 شرايط دمايي اوليه مورد استفاده براي يک واکنش PCR جهت شناسايي qnrA 37
جدول 3-13 مقادير و ترکيبات مورد استفاده براي يک واکنش PCR جهت شناسايي qnrB 37
جدول 3-14 شرايط دمايي اوليه مورد استفاده براي يک واکنش PCR جهت شناسايي qnrB 38
جدول 3-15 مقادير وترکيبات مورد استفاد ه براي واکنش PCR-RFLP پرايمر ( L ) 38
جدول 3-16 مقادير وترکيبات مورد استفاده براي واکنش PCR-RFLP پرايمر ( D ) 38
جدول 4-1 نتايج آنتي بيوگرام 73 ايزوله باليني شيگلا 45
جدول 4-2 جايگاه برش و طول قطعات حاصل از برش توسط آنزيم Hinf1 52
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 4-1 توزيع فراواني سويه هاي جداسازي شده شيگلا در فصول مختلف سال 48
نمودار 4-2 فراواني بيماران بر اساس سن (سال) 49
نمودار 4-3 نتايج مربوط به توزيع سرو گروه هاي شيگلا 50
نمودار 4-4 نتايج الگوي مقاومت آنتي بيوتيکي ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد 51
فهرست تصاوير
عنوان صفحه
تصوير 4-1 گراديانت دمايي به منظور انتخاب دماي بهينه جهت انجام يک واکنش PCR براي ژن gyrA ، سمت چپ مارکر Primer D و سمت چپ مارکر Primer L مي باشد، مارکر مولکولي bp100 47
تصوير 4-2نتايج PCR به منظور تکثير ژن gyrA در برخي ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط پرايمر L ،مارکر مولکولي bp10048
تصوير 4-3 نتايج PCR به منظور تکثير ژن gyrA در برخي ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط پرايمر L ،مارکر مولکولي bp10049
تصوير 4-4 نتايج PCR به منظور تکثير ژن gyrA در برخي ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط پرايمر L ،مارکر مولکولي bp10050
تصوير 4-5 نتايج PCR به منظور تکثير ژن gyrA در برخي ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط پرايمر L ،مارکر مولکولي bp10051
تصوير 4-6 نتايج مربوط به برش آنزيمي (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسيون در ژن gyrA، در برخي از ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط آنزيم Hinf1 مارکر مولکولي bp10 پرايمر مورد استفاده پرايمر L 53
تصوير 4-7 نتايج مربوط به برش آنزيمي (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسيون در ژن gyrA، در برخي از ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط آنزيم Hinf1 مارکر مولکولي bp10 پرايمر مورد استفاده پرايمر L54
تصوير 4-8 نتايج مربوط به برش آنزيمي (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسيون در ژن gyrA، در برخي از ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط آنزيم Hinf1 مارکر مولکولي bp10 پرايمر مورد استفاده پرايمر L55
تصوير 4-9 نتايج مربوط به برش آنزيمي (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسيون در ژن gyrA، در برخي از ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط آنزيم Hinf1 مارکر مولکولي bp10 پرايمر مورد استفاده پرايمر L56
تصوير شماره 4-10 نتايج PCR به منظور تکثير ژن gyrA در برخي ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط پرايمر D ،مارکر مولکولي bp10057
تصوير شماره 4-11 نتايج PCR به منظور تکثير ژن gyrA در برخي ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط پرايمر D ،مارکر مولکولي bp10058
تصوير شماره 4-12 نتايج PCR به منظور تکثير ژن gyrA در برخي ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط پرايمر D ،مارکر مولکولي bp10059
تصوير شماره 4-13 نتايج PCR به منظور تکثير ژن gyrA در برخي ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط پرايمر D ،مارکر مولکولي bp10060
تصوير 4-14 نتايج مربوط به برش آنزيمي (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسيون در ژن gyrA، در برخي از ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط آنزيم Hinf1 مارکر مولکولي bp10 پرايمر مورد استفاده پرايمر D61
تصوير 4-15 نتايج مربوط به برش آنزيمي (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسيون در ژن gyrA، در برخي از ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط آنزيم Hinf1 مارکر مولکولي bp10 پرايمر مورد استفاده پرايمر D62
تصوير 4-16 نتايج مربوط به برش آنزيمي (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسيون در ژن gyrA، در برخي از ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط آنزيم Hinf1 مارکر مولکولي bp10 پرايمر مورد استفاده پرايمر D63
تصوير 4-17 نتايج مربوط به برش آنزيمي (PCR-RFLP) به منظور مشخص کردن موتاسيون در ژن gyrA، در برخي از ايزوله هاي مقاوم به ناليديکسيک اسيد توسط آنزيم Hinf1 مارکر مولکولي bp10 پرايمر مورد استفاده پرايمر D64
تصوير 4-18 بررسي وجود ژن qnrS در سويه هاي جدا شده از نمونه هاي باليني65
تصوير 4-19 بررسي وجود ژن qnrA در سويه هاي جدا شده از نمونه هاي باليني، مارکر مولکولي bp10066
تصوير 4-20 بررسي وجود ژن qnrB در سويه هاي جدا شده از نمونه هاي باليني، مارکر مولکولي bp10067
تصوير3-21 نتايج گراف نمونه شماره 1969
تصوير3- 22 نتايج گراف نمونه شماره 2470
چکيده
شيگلوزيس بطور شايعي مربوط به کودکان بوده به طوري که در اغلب موارد عفونت را کودکان کمتر از پانزده سال سن تشکيل مي دهند. فلوروکينولونها بطور موفقيّت آميزي براي درمان شيگلوزيس، از جمله عفونتهاي ناشي از سويههاي با مقاومت چند گانه آنتي بيوتيکي استفاده ميگردند. اما به مرور زمان سويه هاي مقاوم آنتي بيوتيکي به وجود آمده است، اهميّت اين موضوع به اين دليل است که مصرف بي رويه و غير منطقي آنتي بيوتيک بدون توجه به الگو هاي مقاومتي مي تواند باعث ظهور سويه هايي شود که حتي به درمان هاي جديد نيز مقاومت داشته باشند و ظهور سويه هاي جديد مقاوم به ناليديکسيک اسيد روشن کننده اين واقعيّت مي باشد. بنابراين بررسي مولکولي اين نوع مقاومت ها بسيار حائز اهميّت خواهد بود. گزارشات در خصوص بروز سويههاي شيگلا مقاوم به فلوروکينولون ها محدود است. لذا مطالعه حاضر با هدف بررسي فراواني موتاسيونهاي ژن gyrA ژنهاي و وجود qnr در سويههاي شيگلا هاي جدا شده از بيماران مبتلا به شيگلوز در تهران انجام گرديد. در مجموع 73 سويه شيگلا جدا شده از موارد باليني در اين مطالعه مورد بررسي قرار گرفت. سويههاي شيگلا با استفاده از روشهاي استاندارد ميکروبيولوژيک جداسازي و تعيين هويت گرديدند. تست حساسيت آنتي بيوتيکي و غربالگري سويههاي شيگلا مقاوم به فلوروکينولونها مطابق با دستورالعملهاي استاندارد CLSI انجام پذيرفت. حضور ژنهاي qnr از جمله qnrA، qnrB و qnrS توسط تکنيک PCR با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي مورد بررسي قرار گرفت. همچنين تکثير از لوکوس ژنتيکي ناحيه مقاومت کينولوني ژن gyrA با استفاده از PCR انجام پذيرفت. سپس موتاسيونهاي ژن gyrA توسط تکنيکRFLP و با استفاده از آنزيم محدود الاثر HinfI تعيين گرديد. تمام آمپليکونهاي مربوط به نمونههاي موتانت مشخص شده توسط هضم آنزيمي با ترادف يابي مورد تاييد قرار گرفت. نتايج مربوط به حساسيت آنتي بيوتيکي بر روي 73 نمونه باليني شيگلا نشان داد که 2/97 درصد از ايزوله ها حداقل به يکي از 18 آنتي بيوتيک مقاومت نشان مي دهند و بيشترين ميزان مقاومت به آنتي بيوتيک ها به ترتيب تري متوپريم+سولفامتوکسازول (5/ 94 درصد) و بعد از آن استرپتومايسين (2/93 درصد) و تتراسايکلين (2/93 درصد) بود. همچنين هيچ ايزوله اي به آنتي بيوتيک سيپروفلوکسازين و سفتي زوکسيم مقاومت نشان نداد. 23 (6/31 درصد) ايزوله مقاومت به ناليديکسيک اسيد را نشان دادند. همچنين تمامي نمونه هاي موتانت پس از PCR با استفاده از پرايمر DgyrA و سپس بدنبال انجام هضم آنزيمي الگوي باندي 234و277 جفت بازي را نشان داده و همين نمونه ها در مورد پرايمر LgyrA الگوي باندي315 و333 را به نمايش گذاشتند. نمونه هاي نرمال حاصل از تکثير پرايمر DgyrA نيز پس از انجام RFLP قطعات99و178و234جفت بازي را نشان داده و همين نمونه ها در مورد پرايمر LgyrA قطعات99و234و315 جفت باز را نمايش دادند. تمامي نتايج با Sequencing تاييد گرديد. در خوانش کامل اوليه از موتانت هاي واجد موتاسيون در ژن gyrA، تغير نقطه اي در کدون83 نشان داده شد که حاصل جايگزيني يک نوکلئوتيد به نوکلئوتيد ديگر بوده است. نتيجه اين تغير، جايگزيني اسيد آمينه سرين به لوسين بود. در خوانش کامل دومين موتانت هاي واجد موتاسيون در ژن gyrA، تغير نقطه اي در کدون83 نشان داده شد که حاصل جايگزيني يک نوکلئوتيد به نوکلئوتيد ديگر بوده است. از ميان دو نمونه موتانت شيگلا 1 نمونه (50درصد) به سروتايپ شيگلا فلکسنري و 1 نمونه (50درصد) به سروتايپ شيگلا سونئي تعلق داشت. از ميان 23 سويه مقاوم شيگلا مقاوم به ناليديکسيک اسيد، 4 نمونه واجد ژن qnrS بودند.
مطالعه حاضر، براي اولين بار به صورت جامع، مکانيسم مولکولي مقاومت به ناليديکسيک اسيد در سويههاي شيگلا در تهران را مشخص نمود.
واژههاي کليدي: موتاسيونهاي gyrA، ناليديکسيک اسيد، ژن qnr، شيگلا
فصل اول
کلـيات تحقيق
1- مقدمه
1-1 بيان مسئله
شيگلا يکي از اعضاي خانواده بزرگ باکتريهاي روده اي يعني انتروباکترياسه مي باشد. بيش از چهل سروتايپ مختلف از اين باکتري در چهار گونه يا سروگروه اصلي شامل: سروگروهA ( شيگلا ديسانتريه)، سروگروه B (شيگلا فلکسنري)، سروگروه C (شيگلا بوئيدي) و سروگروه D (شيگلا سونئي) شناسايي شده اند. بيماري شيگلوز (ديسانتري يا اسهال خوني باسيلي) يک گاستروانتريت ناشي از آلودگي با گونه هاي باکتريايي جنس شيگلا مي باشد ; 2003) Ranjbar et al). شيگلوز همراه با درد هاي شديد شکمي، درد، تب، مدفوع خوني و موکوسي شناخته مي شود. در ميان 50 سروتايپ شيگلا ديسانتري تيپ 1 به شدت بيماري زا مي باشد(et al; 2005 Niyogi).
ديسانتري باسيلي بطور شايعي مربوط به کودکان بوده به طوري که هفتاد درصد از موارد عفونت را کودکان کمتر از پانزده سال سن تشکيل مي دهند. شيگلوز از طريق دهاني – مدفوعي انتقال مي يابد. اين بيماري در ابتدا از طريق دستان آلوده افراد و به ميزان کمتر از طريق آب يا غذاي آلوده منتقل مي شودRanjbar et al; 2008)).
سالانه 5 ميليون مورد مرگ و مير ناشي از گاستروانتريت در کشورهاي در حال توسعه رخ مي دهد که دست کم ده درصد اين موارد به دليل ديسانتري ناشي از شيگلا است (Koorosh et al; 2003). اغلب موارد شيگلوز در سنين پس از شير خوارگي به خصوص در سن نوپايي ديده مي شودMache et al; 1997)). اثر منفي عفونت شيگلايي بر رشد و نمو و سوء تغذيه کودکان در مطالعات مختلف نشان داده شده است. شيوع عفونت شيگلايي در ميان عوامل ايجادکننده گاستروانتريت هاي حاد بر اساس مطالعات انجام شده در تهران 1 تا 2 در صد مي باشد. به نظر مي رسد، تنوع فراواني الگو هاي ژنتيکي موجود در يک گونه شيگلا مانند: شيگلا سونئي در يک کشور باعث بروز الگوها ي متنوع مقاومت به آنتي بيوتيک شده است. الگوي متنوع مقاومت به آنتي بيوتيک در نقاط مختلف جغرافيايي همواره انتخاب يک داروي مناسب براي شيگلا را مشکل کرده است و به همين علّت، انجام مطالعات مقاومت دارويي ضروري است. با توجه به افزايش مقاومت به آنتي بيوتيک هاي مختلف در سال هاي اخير در نقاط مختلف دنيا، انتخاب بيماران که کانديدهاي درمان آنتي بيوتيکي هستند از اهميّت بالايي برخورداراست (Peirano et al; 2006).
پاتولوژي پيچيده سندرم اسهال خوني بازتابي از وجود تركيبات متنوع ژنتيكي كنترل كننده بيماري زايي اين ارگانيسم است. مهمترين عامل بيماري زا در اين باکتري اگزو توکسين آن مي باشد، که به دو زير واحد A وB با سميّت بسيار بالا تقسيم مي شود که يک مولکول هگزامري با وزن مولکولي حدود 70 کيلو دالتون است که با اتصال به رسپتور هاي سطحي سلول هدف باعث اپوپتوزيس و مرگ سلول خواهد شد. اين توکسين را شيگلا ديسانتري نوع 1 توليد مي کند و توکسيني مشابه آن را اشرشيا کولي توليد مي کند به نام هاي 1stx و2stx که تا 98 درصد تشابه دارند. حساسيت سلول هاي اندوتليال کليه انسان به stx در مقايسه با 1stx تا 1000 برابر بيشتر است به همين دليل عامل اصلي بيماري خون ادراري HUS معرفي گرديده است. سميّت و قدرت ايمني زايي شيگا توکسين stx بسيار بالا مي باشد به شکلي که حدود 28 نانو گرم از آن باعث مرگ يک موش مي شود و همچنين به دليل داشتن قدرت آنتي ژني بالا داراي پتانسيل ايجاد پاسخ ايمني و توليد آنتي بادي عليه توکسين در بدن بيمار مي شود. زير واحد stxBبا 69 اسيد آمينه و زير واحد stxAبا حدود 294 اسيد آمينه با وزن مولکولي در حدود 32 کيلو دالتون متصل است. رسپتور زير واحد B به رسپتور سطحيGb3 متصل شده و تشکيل يک کمپلکس را مي دهد (Goguen et al; 2003).
افزايش مقاومت نسبت به اکثر آنتي بيوتيک هاي رايج به يک نگراني بزرگ در کشورهاي توسعه يافته و در حال توسعه تبديل شده است. کينولون ها ازجمله ناليديکسيک اسيد به عنوان داروي خط اول در درمان عفونت هاي ناشي از شيگلا مورد استفاده قرار مي گيرد، اما متأسفانه در برخي از مطالعات مقاومت به اين آنتي بيوتيک گزارش شده است. براي مثال در ايران نتايج مطالعات نشان داده است در سال هاي 2001 تا 2003 ، ميزان مقاومت به اين آنتي بيوتيک 13 درصد بوده و اين ميزان در سال هاي 2004 تا 2006 به 25 درصد افزايش يافته است. ناليديکسيک اسيد به دليل مقرون به صرفه بودن از مناسب ترين آنتي بيوتيک ها به شمار مي آيد. کينولون ها و فلوروکينولون ها ترکيباتي هستند که هدف آنها DNA جيراز و توپوايزومراز IV مي باشد و با ايجاد کمپلکس دارو سبب جلوگيري از سنتز اسيد نوکلئيک مي شوند. با توجه به افزايش مقاومت و انجام نگرفتن مطالعات جامع مولکولي بر روي سويه هاي مقاوم نسبت به ناليديکسيک اسيد، بر آن شديم به مطالعه شيوع موتاسيون ها بر روي ژنgyrA و بررسي وجود ژنهاي qnr در سويه هاي سويه هاي مقاوم نسبت به ناليديکسيک اسيد شيگلا جدا شده در تهران بپردازيم.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

1-2 کليات
1-2-1 باکتريولوژي شيگلا
شيگلا متعلق به خانواده انتروباکترياسه مي باشد. اين باکتري غير متحرک و بدون کپسول مي باشد. 4 گونه شيگلا وجود دارد که بر اساس خصوصيات بيوشيميايي مختلف طبقه بندي مي شوند. زير گروه A (شيگلا ديسانتريه)، زير گروه B (شيگلا فلکسنري)، زير گروه C (شيگلا بوئيدي) و زير گرو ه D )شيگلا سونئي) مي باشند. شيگلا ديسانتريه بيشتر مورد توجه مي باشد چون بيماري حاد تري را ايجاد مي کند و عامل ايجاد اپيدمي هاي مختلف با ارگانيسم هاي مقاوم به آنتي بيوتيکي و توليد کننده شيگا توکسين مي باشد. اين دسته از باکتري هاي روده اي بي هوازي اختياري، اکسيداز منفي، لاکتوز منفي و غير متحرك اند، قادر به تخمير گلوکز بوده و از تخمير گلوکز گاز توليد نمي کنند، اوره منفي و همچنين سيترات منفي هستند.
در محيطTSI، هيدروژن سولفوره (H2S)توليد نکرده و ليزين منفي مي باشند. هوازي و بي هوازي اختياري و حرارت مناسب براي رشد آنها 37 درجه مي باشد. اين باکتريها يکي از مهمترين عوامل بيماريزاي قابل انتقال از طريق غذا و آب آلوده بوده و به عنوان يکي از مشکلات بهداشتي در سراسر جهان محسوب مي گردند (Brooks et al; 2007).
1-2-2 طبقه بندي شيگلا
نام شيگلا برگرفته از نام ميکروب شناس ژاپني Kiyoshi Shiga مي باشد که اولين بار اين ارگانيسم را در سال 1896 کشف نمود. جنس شيگلا شامل 4 گونه مي باشد: شيگلا ديسانتريه، شيگلا فلکسنري ، شيگلا بوئيدي ، و شيگلا سونئي. شيگلا ديسانتريه يا زير گروه A شامل 10 سرووار است، هر سرووار يک آنتي ژن اختصاص به خود دارد که بوسيله آن متمايز مي شود. شيگلا فلکسنري يا زير گروه B شامل 8 سروار و 9 ساب سروار مي باشد. سروار ها از نظر آنتي ژني به هم وابسته هستند اما هرکدام يک آنتي ژن بزرگ متمايز دارند. شيگلا بوئيدي يا زير گروه C شامل 15 سرووار است و هر سروار يک آنتي ژن اختصاصي دارد. آنها ممکن است با آنتي سرم هاي ساير گونه هاي شيگلا واکنش متقاطع ايجاد کنند، اما در تشخيص آنها تداخلي پيش نمي آيد . شيگلا سونئي يا زير گروه D تنها داراي يک سرووار مي باشد که در دو فاز II و I وجود دارد، و هر فاز يک آنتي ژن اختصاصي دارد. باکتري ممکن است در طي دوره بهبودي يا در اواخر دوره بيماري از بيماران مبتلا جدا شود .آنتي سرم هاي اختصاصي IIفاز براي تشخيص هر دو فاز مورد نياز است Ranjbar et al; 2003)).
بيماري شيگلوز عمدتاً توسط شيگلا سونئي، شيگلا فلکسنري A و شيگلا ديسانتري تيپ 1 ايجاد مي شود که در کشور هاي در حال توسعه شيوع بيشتري دارند. شيگلا ديسانتريه تيپ 1 بيماري حاد ايجاد مي کند و مي تواند عوارض مرگ باري به وجود آورد. اين تيپ معمولا مقاوم به چند دارو بوده و باعث مرگ ومير بالا مي شود.
1-2-3 فاکتورهاي ويرولانس شيگلا
آنها در ابتداي ورود به روده مي توانند ايجاد بيماري کنند زيرا قابليت حمله به سلول هاي روده کوچک را دارند. ژنوم كروموزومي و خارج كروموزومي براي به وجود آمدن اين فنوتيپ بيماري زا ضروري است. يكي از جنبه هاي اين فنوتيپ، تهاجم به سلولهاي اپتليالي كولون است كه تركيب ژنتيكي آن بر روي يك پلاسميد بزرگ مي باشد(1987 Bysse et al;).يکي از فاکتور هاي ويرولانس آنها ليپوپلي ساکاريد صاف مي باشد که در ديواره سلول قرار مي گيرد. شيگا توکسين داراي دوزير واحد A و B است. زير واحد A زير واحد ساختاري اين توکسين مي باشد، زير واحد Aقسمت S 28 از RNA ريبوزومي مربوط به زير واحد S 60 را مي شکند بنا براين مانع از اتصال آمينو اسيل ترانسفراز به RNA شده و در نتيجه با مهار سنتز پروتئين، اثرات مخرب خود را بر روي اپيتليوم روده بر جاي مي گذارد. زير واحدB اتصالي است. زير واحد B اتصال به رسپتور هاي اختصاصي سلول را به نام گليکوليپيد Gb3واسطه گري مي کند و سبب تسهيل ورود زير واحد A به داخل سلول مي شود. شيگا توکسين باعث ايجاد سندروم هموليتيک اورميک مي شود و مکانيسم اين علائم پاتوژنيک، ممکن است در اتصال توکسين به اپيتليال باشد که نتيجه آن هموليز و پارگي مويرگ ها و ضايعات گلومرولي مي باشد((Keush et a; 1998 & Bennish et al ; 1998.
توکسيني مشابه آن را اشرشيا کولي توليد مي کند به نام هاي 1Stx و 2Stx که تا 98 درصد تشابه دارند. حساسيت سلولهاي اندوتليال کليه انسان به stx در مقايسه با 1 Stx تا 1000 برابر بيشتر است. به همين دليل عامل اصلي بيماري خون ادراري HUS معرفي گرديده است. سميّت و قدرت ايمني زايي شيگا توکسين Stx بسيار بالا مي باشد، به شکلي که حدود 28 نانو گرم از آن باعث مرگ يک موش مي شود و همچنين به دليل داشتن قدرت آنتي ژني بالا داراي پتانسيل ايجاد پاسخ ايمني و توليد آنتي بادي عليه توکسين در بدن بيمار مي شود. رسپتور زير واحد B به رسپتور سطحيGb3 متصل شده است و تشکيل يک کمپلکس را مي دهد(2003 Goguen et al;).
ارگانيسم هاي شيگلا به سلول هاي اپيتليال حمله کرده و باعث مرگ سلولي وزخم هاي موکوسي مي گردند، که اين عفونت ها در شيگلا ديسانتري تيپ1، حاد تر مي باشد (Dipika et al; 2004).
ارگانيسم هاي شيگلا به ندرت به سيستم گردش خون حمله مي کنند. يکي از مشخصه هاي بارز ديسانتري باسيلي اين است که اختلال تنفسي در سلول به وجود مي آيد و نتيجه آن نکروز اپيتليوم کولونيک مي شود. از علائمي که مي تواند توجيه کننده اين موضوع باشد مي توان به افزايش سطوح پيروات و کاهش لاکتات وATP اشاره کرد((Bhargava et al;1995 که همه اين عوارض در ديسانتري تيپ 1 بيشتر است. شيگلا خاصيت حمله به اريتروسيت ها را دارد. آنها پس از حمله به اريتروسيت ها واکوئل ها ي موجود در فاگوسيت ها را ليز مي کنند سپس به سلول هاي سيتوپلاسم حمله مي کنند و آنها را از بين مي برند. شيگلا طي يک فرايند فاگو سيتوز به سلول هاي اپيتليال حمله مي کند. زماني که شيگلا با سلول ها برخورد مي کنند و آنها را آلوده مي کنند باعث مي شود تغييراتي در اکتين سيتوپلاسم ها به وجود آيد، فيلامنت هاي اکتين ميوزين سبب احاطه شدن و مستحکم کردن باکتري مي شود. در مرحله بعدي واکوئل ها توسط پلاسميد هاي باکتري ليز شده و سر انجام باکتري شيگلا به داخل سلول ميزبان رها مي شود (.(High et al;1992 انتشار سلول به سلول زماني که شيگلا در حال آلوده کردن سيتوپلاسم مي باشد از طريق تشکيل يک موتور سيتواسکلتي صورت مي گيرد (Bennich et al ; 1998 ).
سويه هاي فاقد اين خاصيت نيز پاتوژن مي باشند. اگزوتوکسين ها مسئول ايجاد علائم باليني ديسانتري باسيلي مثل تب، خستگي و بدن درد هستند. از آنجايي که مخاط روده کوچک در انسان ها مورد تهاجم قرار نمي گيرد، مي توان نتيجه گرفت که اين ميکروارگانيسم در حين عبور از روده کوچک مي تواند توکسين ترشح کند. در پاسخ به عفونت چهار پروتئين سبب بر انگيحتن پاسخ هاي ايمني (آنتي بادي) مي شوند که به نام هاي ، IPa(70KDa)، IPB(62KDa)، IPC(43KDa) ، IPD(38KDa) مي با شد ، پروتئينIpa (آنتي ژنهاي پلاسميدي مهاجم ( در غشاي باكتري هاي قرار دارند و در روند اندوسيتوز باكتري نقشي دارند((Islamd D et al ;1997,.
IpaB يكي از فاكتورهاي بيماريزاي شيگلاست، وزن مولكولي آن 57 كيلودالتون و اندازه ژن آن 1743 نوكلئوتيد حاوي 580 اسيد آمينه است(Buysse JM, et al ; 1987) . اين ژن يك پروتئين ترشحي توليد مي كند و در سيتوپلاسم ماكروفاژهاي آلوده قرار مي گيرد. IpaB جهت القاء آپپتوز در ماكروفاژها كافي است و اين كار را با اتصال مستقيم به تركيب اساسي ماشين مرگ IL-1b انجام مي دهد(Guichon A et al ;2001) . سيستم ترشحي نوع 3 سبب ترشح اين چهار نوع پروتئين به داخل سلول هاي اپيتليال شده و سبب تغيراتي در غشا و وارد شدن باکتري به روش فاگوسيتوز مي شود(Ranjbar et al; 2012).
1-2-4 توصيف علائم بيماري ناشي از عفونت با شيگلا
ديسانتري باسيلي يا شيگلوز يك عفونت روده اي است كه علائم آن از يك اسهال آبكي تا يك التهاب شديد گسترده است. اين بيماري با دردهاي شديد شكمي، تب، مدفوع حاوي خون و موكوس شناخته مي شود. اين بيماري جز در مواردي كه بيمار داراي نقص ايمني باشد يا درمان هاي اوليه پزشكي در دسترس نباشد، معمولا خود محدود شونده استBennish et al; 1991) ). در برخي از موارد ممکن است نشانه هايي از بيماري ديده نشود اما در افراد ديگر ديسانتري ملايم و حاد به همراه تب کرمپ شکمي و درد ايجاد کند. همچنين در کودکان مي تواند تب خيلي بالا، تشنج و سوء تغذيه ايجاد کند. شيگلا سونئي اسهال خوني ملايم را ايجاد مي کند، شيگلا فلکسنري و شيگلا ديسانتريه، اسهال خوني حاد را ايجاد مي کنند. شيگلوزيس ممکن است همراه با يک و يا چند عوارض مرگ بار باشد (Barrett et al; 1970). در ميان 50 سروتايپ و ساب تايپ شيگلا، شيگلا ديسانتري تيپ 1 به شدت بيماري زا است. شيوع اسهال خوني ناشي از شيگلا ديسانتريه تيپ يك در نواحي پر جمعيت و با بهداشت پائين بالاتر است. اين تنها ساب تايپ ايجاد كننده اپيدمي و پاندمي در جهان است (McKenzie et al; 2008 ). در کودکان تب بالا، تشنج، آرتريت، پاره شدگي روده بزرگ، خونريزي، انتروپاتي و دفع پروتئين را ايجاد مي کند (Bennish et al; 1991) . واکنش لوکوموئيد (تعداد WBC>5000) و سندروم هموليتيک اورميک (خونريزي مويرگ ها، از کار افتادن کليه ها ) در شيگلا ديسانتري تيپ 1 ممکن است مرگ بار باشد (Dipika et al; 2004). در بيماران که مبتلا بهHIV هستند با علائمي مانند سپتي سميّ، ايجاد سوراخ در روده کوچک، سميت در روده بزرگ، دهيدراسيون، کمبود سديم، عفونت در مغز، ذات الريه،و ادرار خوني همراه است. همچنين ديسانتري باسيلي به همراه ديسانتري مداوم مي تواند آسيب به روده بزند و باعث دفع پروتئين و سو ء تغذيه شود(Bennish et al; 1991) .
1-2-5 اپيدميولوژي
ديسانتري باسيلي بطور شايعي مربوط به کودکان بوده بطوري که هفتاد درصد از موارد عفونت را کودکان کمتر از پانزده سال سن تشکيل مي دهند. ديسانتري باسيلي از طريق دهاني – مدفوعي انتقال مي يابد. اين بيماري در مرحله اول از طريق دستان آلوده افراد و به ميزان کمتر از طريق آب يا غذاي آلوده منتقل مي شود ;2008) Ranjbar et al). شيگلا ديسانتريه در کشور هاي در حال توسعه شيوع بيشتري دارد ولي شيگلا فلکسنري A2در کشور هاي صنعتي ميزان مرگ و مير بالاتري را به خود اختصاص داده است. در مورد شيوع شيگلا در ايران آمار رسمي موجود نيست اما بنا بر نتايج برخي تحقيقات در تهران، شيگلا سونئي گونه غالب جدا شده از بيمارن است; 2003 ) Ranjbar et al). ديسانتري باسيلي شديداً مسري بوده و انسان ميزبان اصلي سويه هاي شيگلا مي باشد. اين ارگانيسم مقاوم به اسيد بوده و به راحتي مي تواند از معده آن عبور کند. راه هاي شايع انتقال آن انسان به انسان و از آب و غذاي آلوده مي باشد. کارکنان فراوري هاي غذاي آلوده مي توانند بيماري را انتقال دهند. گاهي چيدن و مصرف سبزيجات و ميوه هاي خام و مصرف آنها که با فاضلاب و کود هاي حيواني رشد کرده اند مي تواند ايجاد آلودگي کند. مگس ها مي توانند با نشستن بر روي مدفوع آلوده و انتقال آن به غذاي انسان بيماري را انتقال دهند. شستن و استحمام کردن در برکه ها که در هند رايج است نيز مي تواند باعث انتقال بيماري در صورت آلوده بودن آب با مدفوع فرد مبتلا گردد. اين بيماري در مکان هاي شلوغ و فقير که بهداشت کم مي باشد شايع تر مي باشد با اين وجود توريست هايي که به مناطق آلوده سفر کرده اند نيز مي توانند مبتلا شوند(WHO; 2001 ). انسان تنها ميزبان شيگلا مي باشند. دوز عفوني آن کمتر از 200 سلول باکتري مي باشد و انتقال آن در مناطق شلوغ با بهداشت ضعيف آسان تر مي باشد(Levine et al 1991 & Dupont et al; 1989 )
اين بيماري در کشور هاي در حال توسعه، يک بيماري شايع در کودکان مي باشد اما در کشور هاي توسعه يافته اکثراً در مهد کودک ها، زندان ها، پادگانها، و در نواحي که سرخ پوستان زندگي مي کنند وجود دارد Bennish; 1998 ) .(Keusch & . با اين وجود اين بيماري از طريق غذا در افرادي که در معرض خطر نيستند هم انتقال مي يابد. مسير انتقال آن مدفوعي دهاني مي باشد که از طريق آب، غذا، و انسان به انسان نيز منتقل مي شود و شستن دستان آلوده ميزان انتقال را کاهش مي دهد. در برخي از مناطق ميزان شيوع در فصل موسمي افزايش پيدا مي کند شايد به دليل افزايش آلودگي مدفوعي آب آشاميدني باشد. همچنين شواهدي موجود است که مگس خانگي نيز عامل انتقال مي باشد(Levine et al; 1991 & 1993 ).


پاسخ دهید