3-2-1-تهيه محلول(%25) SDS:42
3-2-2- محلول EDTA(5/0 مولار):42
3-2-3-تامپون ليز کننده سلول42
3-2-4- تامپون TE حاوي RNase42
3-2-5- بافر(5X)TBE:42
3-2-7- محلول فنل-کلروفروم-ايزو آميليک الکل(PCI):43
3-3- روش انجام طرح:44
3-3-1- نوع مطالعه:44

3-3-2-جامعه مورد مطالعه:44
3-3-3- جمع آوري اطلاعات:44
3-3-4- انجام امور باکتريولوژيک:44
3-4- ژنوتايپينگ ايزوله هاي سالمونلا با استفاده از روش MLVA46
3-4-1- انجام آزمايش PCR جهت تکثير لوکوس هاي VNTR46
3-4-2- الکتروفورز محصولات VNTR50
3-4-3- محاسبه ي اندازه و تعداد تکرار هاي VNTR52
3-4-4-تجزيه و تحليل داده هاي VNTR 52
فصل چهارم يافته ها54
4-1- نمتايج حاصل از جمع آوري نمونه ها 55
4-2- نتايچ حاصل از استخراج ژنوم باکتريايي57
4-3- نتايج حاصل از واکنش PCR جهت تکثير لوکوس هاي VNTR58

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

4-4- ميزان تنوع الل هاي VNTR74
4-5- آناليز داده ها با استفاده از الگوريتم Minimum Spanning Tree 74
4-6- آناليز داده هاي VNTR با استفاده از روش NJ75
فصل پنجم :بحث ونتيجه گيري 77
5-1- بحث78
5-2- نتيجه گيري و جمع بندي91
منابع:92
چکيده انگلسي 96

فهرست جداول و نمودارها
عنوان صفحه
جدول1-1، ويژگي هاي بيو شيميايي سالمونلا8
جدول 1-2، طبقه بندي نوين سالمونلا و ميزان سروتايپ ها در زير گونه ها9
جدول 3-1، نام لوکوس ها و پرايمر هاي اختصاصي47
جدول 3-2،مقاديرموردنيازجهت انجام واکنش هايPCRبراي تکثيرلوکوسهايVNTR48
جدول 3-3، برنامه ريزي دستگاه ترموسايکلر جهت تکثير لوکوس هاي SENTR2،
SENTR3 و SE-749
جدول3-4،برنامه ريزي دستگاهترموسايکلرجهت تکثيرلوکوسهايENTR6وSE-849
جدول 3-5، برنامه ريزي دستگاه ترموسايکلر براي تکثير لوکوس SE-4 49
جدول 3-6، برنامه ريزي دستگاه ترموسايکلر جهت تکثير لوکوس SE-1050
جدول 3-7، برنامه ريزي دستگاه ترموسايکلر جهت تکثير لوکوس SE-650
جدول 4-1، در فايل EXCEL73
جدول 4-2، ضريب تنوع هانتر- گاتسون براي هر لوکوس محاسبه شده 74
نمودار 4-1، ميزان فراواني هر يک از سرو تايپ هاي سالمونلا در پژوهش حاضر56
نمودار 4-2، ميزان شيوع هر يک از سرو تايپ هاي سالمونلا در پژوهش حاضر56
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 1-1 تصوير دکتر سالمون دامپزشک آمريکايي.5
شکل1-2 باکتري سالمونلا 6
شکل 1-4ماي شماتيک از VNTR ها 23
شکل 1-5 پروفايل اللي 24
شکل 1-6 آناليز MLVA بوسيله MST 25
شکل 1-7، مزاياي MLVA 26
شکل 1-8، مراحل انجام MLVA 27
شکل 4-1، ميزان خلوص DNA نمونه ي شماره ي 5357
شکل 4-2، ميزان خلوص DNA نمونه ي شماره ي 2457
شکل 4-3، لوکوس ENTR6 58
شکل 4-4، لوکوس SE4 59
شکل 4-5، لوکوس SE4 60
شکل 4-6، لوکوسSE6 61
شکل 4-7، لوکوس SE6 62
شکل 4-8، لوکوسSE7 63
شکل 4-9، لوکوسSE7 64
شکل 4-10، لوکوسSE8 65
شکل 4-11، لوکوسSE8 66
شکل 4-12، لوکوسSE10 67
شکل 4-13، لوکوسSE10 68
شکل 4-14، لوکوسSENTR2 69
شکل 4-15، لوکوسSENTR2 70
شکل 4-16، لوکوسSENTR3 71
شکل 4-17، لوکوسSENTR3 72
شکل 4-18، آناليز داده هاي VNTR با استفاده از الگوريتم MST. 75
شکل 4-22، درختچه ي NJ 76
چکيده فارسي :
ژنوتايپينگ سويه هاي سالمونلا انتريکا سرووار انتريتيديس جدا شده از نمونه هاي باليني در تهران بر پايه روش آناليز چند لوکوسي متغير تکراري( MLVA)
مقدمه:سالمونلاانتريکا سبب ايجاد سالمونلوزيس در انسان مي شود. سالمونلا انتريکا سرووار انتريتيديس، دومين سروتايپي مي باشد که در سطح دنيا سبب ايجاد سالمونلوزيس مي شود. تکنيک MLVA، يکي از روش هاي نوين ژنوتايپينگ جهت تمايز ايزوله هاي باکتريايي در همه گيري ها و يا تعيين قرابت فيلوژنتيکي اين ايزوله ها مي باشد. هدف از اين پژوهش، ژنوتايپينگ سويه هاي سالمونلا انتريتيديس جدا شده از نمونه هاي باليني در تهران بر پايه ي روش MLVA.
مواد و روش ها: در اين پژوهش، 51 ايزوله ي سالمونلا انتريکا سرووار انتريتيديس از نمونه هاي باليني در طي سال هاي 1387 تا 1389 در تهران جدا شدند. ايزوله هاي سالمونلا انتريتيديس با استفاده از تکنيک هاي بيوشيميايي و سرولوژيکي تاييد شدند. جهت انجام تکنيک MLVA، از هشت لوکوس VNTR استفاده شد.
نتايج: 10 ژنوتايپ متفاوت MLVA، در اين پزوهش شناسايي شد. با استفاده از روش MST، 51 ايزوله ي سالمونلا انتريتيديس در 2 کلونال کمپلکس قرار گرفتند. همچنين با استفاده از تکنيک NJ، اين ايزوله ها در دو کلاستر جاي گرفتند.
بحث و نتيجه گيري: نتايج حاصل از اين پژوهش نشان داد که تکنيک MLVA، يک روش قدرتمند و آسان مي باشد و مي توان از اين تکنيک در اپيدمي ها ي ناشي از سالمونلا انتريتيديس استفاده نمود.
کلمات کليدي: سالمونلا، MLVA، VNTR
کليات تحقيق
1-2-
بيان مسئله
سالمونلا1 باسيل گرم منفي،واجدتاژک پري تريش وجزءخانوادهيانتروباکترياسهميباشد.گروه سالمونلا شامل يک جنس منفرد به نام سالمونلا است. اين جنس شامل ارگانيسم هايي است که قبلا تحت عنوان سالمونلا و آريزونا شناخته مي شدند. وقتي سالمونلا ها از طريق مسير خوراکي به انسان و حيوانات منتقل شوند، بيماريزا هستند. اين باکتري از طريق حيوان و فروارده هاي حيواني به انسان سرايت مي کنند و موجب تب روده اي، مسموميت هاي غذايي و گاستروانتريت در انسان مي شوند(7).
طبقه بندي سالمونلا در طي ساليان متمادي دچار تغييرات زيادي شده است. سالمونلا گروه بزرگي از باکتري هاي روده اي شامل تقريبا 2200 سروتايپ مي باشد. بر مبناي مدل اخير طبقه بندي CDC تنها يک گروه منفرد از سالمونلا وجود دارد که به هفت زير گروه(1،2،،a3،b3،4،5،6) طبقه بندي مي شوند. طبقه بندي اخير بر مبناي شباهت ژنتيکي ايزوله هاي سالمونلا) 16S r RNA) است. سيستم هاي طبقه بندي قديمي تر شامل 1) طبقه بندي کافمن_وايت: که هر سروتايپ را به صورت يک گونه منفرد سالمونلا شناسايي مي کند. 2) سيستم ادواردز_اوينگ: که سالمونلاها را به سه گونه( سالمونلا کلراسوئيس، سالمونلا تايفي، سالمونلا انتريتيديس) و صدها سروتايپ تقسيم بندي مي کند. 3) مدل هيبريداسيون DNA: که سالمونلا ها را به يک گونه به نام سالمونلا انتريتيديس و زير گونه هاي اريزونه2، بونگوري3، دي اريزونه4، انتريکا5، سالاما6،هاتنا7، تقسيم مي نمايند که طبقه بندي CDC با کمي تغيير از همين طبقه بندي استفاده مي کند (4-6).
روش هاي مختلفي براي جداسازي باکتري سالمونلا از نمونه هاي محيطي وجود دارند که شامل: روش هاي کشت سنتي و بيوشيميايي، سرولوژي و مولکولي مي باشد. در کشت سنتي از محيط هاي پيش انتخابي و اختصاصي نظير S.S Agarو XLD Agar استفاده مي شود. روش هاي سرولوژي براساس واکنش انتي بادي با انتي ژن توليدي توسط باکتري مي باشد.
استفاده از روش هاي سرولوژيک بدليل تنوع گسترده خصوصيات آنتي ژنتيکي باکتريايي و نياز به طيف گسترده و وسيعي از آنتي بادي ها و همچنين هزينه گزاف توليد و مصرف آن، به مرور جايگاه خود را از دست داده اند. تا کنون از روش هاي مولکولي متنوعي جهت ژنوتايپينگ گونه هاي مختلف سالمونلا استفاده شده است. به کارگيري اين روش ها، اهميت ويژه اي در پژوهش هاي اپيدميولوژيکي دارد . با شروع عصر مولکولي دانشمندان رويکرد خود را از فنوتيپ به ژنوتيپ تغيير داده اند.
روش هاي مختلفي مثل Rep- PCR، RAPD- PCR، Ribotyping، PFGE، MLST و MLVA جهت ژنتوتايپينگ سويه هاي سالمونلا تا به حال مورد استفاده قرار گرفته است بطوريکه هريک ازاينروش ها معايب و مزايايي دارند، که در اين ميان روش MLVA8 از روش هايي مولکولي جديد و نويني جهت ژنوتايپينگ باکتريايي مطرح شده است و بر اين اساس توسعه يافتهُ است(7).
اين روش با مزايايي که نسبت به تکنيک PFGE9 دارد روز به روز به اهميت و محبوبيت آن افزوده مي شود. بطوريکه در آينده جايگاه ويژه اي در بين اپيدميولوژيست ها خواهد داشت. در تکنيک MLVA بطور خاص، توالي هاي تکراري پشت سر هم10 مورد بررسي و ارزيابي قرار مي گيرند و از نظر تعداد تکرار هاي VNTR11 با يکديگر مقايسه مي شوند. مجموعه اي از اين تکرار ها بصورت دسته اي از اعداد که در اصطلاح پروفايل اللي12 گفته مي شود. براي هر سويه باکتري نمايش داده مي شود و به عنوان يک کد اطلاعاتي براي آن سويه در نظر گرفته مي شود. (7)
MLVA داراي مزاياي زيادي نسبت به PFGE مي باشد. در MLVA تنها نياز به دستگاه PCR است و اين روش يک تکنيک PCR-bassed ميباشد در حاليکه در PFGE نياز به امکانات و تجهيزات مخصوص و پر هزينه است. در MLVA تنها داشتن DNA باکتري کافيست در حاليکه در PFGE نياز به باکتري زنده است.هزينه MLVA به مراتب از PFGE کمتر است و بسيار سريع تر از آن انجام پذير مي باشد. و نکته بسيار مهم اينست که، داده هاي حاصل از MLVA از آنجايي که بصورت مجموعه اي از ارقام ذخيره مي شود را مي توان به راحتي در بانک هاي اطلاعاتي ذخيره نمود و با نتايج ساير پژوهشگران مقايسه نمود هر چند چنين چيزي در PFGE ديده نمي شود گرچه تلاش هاي مانند شبکه Plus Net در جهت حل اين موضوع ايجاد شده است.به اين ترتيب MLVA بعنوان يک تکنيک جايگزين PFGE براي کشور هاي در حال توسعه مطرح مي باشد (7).
هر گونه باکتريايي، توالي هاي VNTR مخصوص به خود را دارد که مي توان با طراحي پرايمر براي آنها، الل مورد نظر را تکثير داد و از نظر تعداد تکرار مورد بررسي قرار داد. در طرح حاضر سعي شده است با انتخاب توالي هايVNTR مناسب، يک روش جديد، کم هزينه، سريع براي ژنوتايپينگ سويه هاي سالمونلا انتريکا سرووار انتريتيديس13 بکار گرفته شود تا در آينده بتواند جايگزين روش هاي گرانقيمتي مانند PFGE شود و بتوان از آن در آزمايشگاه هاي تحقيقاتي که تنها تجهيز به دستگاه PCR باشند، استفاده نمود و بتواند به سرعت هر نوع اپيدمي را شناسايي کند و پژوهشگران بتوانند نتايج خود را با يکديگر مقايسه نمايند(7).
1-2- کليات
1-2-1، تاريخچه
دو دانشمند فرانسوي با نام هاي کومل14 و لوئي15 در اوايل قرن نوزدهم ميلادي علائم کلينيکي تب تيفوئيد را بررسي کردند. در سال 1823 ميلادي برتونئو16 به علت تورم غدد لنفاوي روده آن بيماري را به نام روده جوشان17 نام گذاري نمود. کرهارد18 در اپيدمي تيفوئيد در فيلادلفيا ايالات متحده آمريکا در سال 1837 ميلادي، تيفوس و حصبه را از متمايز کرد.در سال 1839 ميلادي شونلين19 تيفوس را به نام تيفوس اگژنتماتيکوس20 و حصبه را تيفوس احشايي21 نام گذاري نمود. در ميان سال هاي 1849-1851 در انگلستان، جنر22 با استفاده از علائم بيماري هاي تب دانه دار، حصبه را تشخيص داد و عامل آن را سالمونلا تايفي23 ناميد. اسم سالمونلا بر گرفته شده از دامپزشک آمريکايي به نام دکتر دانيال المر سالمون24 مي باشد که به پاس تحقيقات و زحمات گسترده اين دانشمند نام گذاري شده است.هوپ25 در سال 1886 از ادرار، فيفير در سال 1885 از مدفوع، در سال 1888 ويلچور از خون سالمونلا را جدا نمودند.در سال 1896 سيکارد و ويدال آنتي بادي عليه سالمونلا را از خون جداسازي کردند (2و3) .
شکل 1-1: تصوير دکتر سالمون دامپزشک آمريکايي.
1-2-2، باکتريولوژي سالمونلا
سالمونلا از اجزاي خانواده انتروباکترياسه مي باشد که واجد تاژک پري تريش مي باشد(4) اين باکتري از طريق حيوانات و محصولات حيواني آلوده به اين باکتري به انسان منتقل شده و سبب بيماري در انسان مي شود(4). ساليانه تخمين زده مي شود 1.4 ميليون نفر در ايلات متحده آمريکا توسط سالمونلا بيمار مي شوند(8).
بيشتر سروتايپ هاي اين باکتري براي انسان و اکثر حيوانات بيماريزا هستند. سالمونلا در دستگاه گوارش مهره داران يافت شده و بيماري هاي متعدد با علائم متفاوت را ايجاد مي نمايد(9). يکي از علل مهم مسموميت هاي غذايي در اروپا و ايالات متحده آمريکا، سالمونلا انتريکا سرووار انتريتيديس مي باشد. براورد شده است که 93.8 ميليون نفر سالانه در کل جهان به سالمونلا مبتلا مي شوند که نتيجه آن 155000 مورد مرگ در سال مي باشد.
شکل1-2: در شکل سمت چپ باکتري سالمونلا با تاژک پري تريش ديده مي شود و در شکل سمت راست ميزان شيوع باکتري سالمونلا در سطح جهان را نشان مي دهد.
1-2-3، تست ها و خواص بيوشيميايي
اين باکتري تست اندول و ONPG آن منفي بوده و لاکتوز را تخمير نمي کند اما اين باکتري متحرک بوده و تست سيترات و SH2 آن مثبت مي باشد. واکنش آنتي بادي عليه آنتي ژن هاي Vi و H و O اين باکتري مبناي سروتايپينگ سالنونلا است.
در حاليکه مبناي اصلي طبقه بندي سالمونلا سروتايپينگ آنتي ژن هاي سطحي مي باشد اما اساس تفريق سروتايپ تايفي تست هاي بيوشيميايي مي باشد . سروتايپ تايفي از نظر تست هاي بيوشيميايي به صورت خنثي مي باشد. سروتايپ تايفي در همه تست هاي توليد گاز از گلوکز، موسينات،آرابينوز، سيمون سيترات، اورني تين دکربوکسيلاز و مصرف استات منفي را بروز مي دهد. سروتايپ تايفي مسئول تيفوئيد بوده و ساير سروتايپ ها باعث انتريت و انتروکوليت مي شود(4, 9, 10).
ويژگي هاي بيوشيميايي سالمونلا همان ويژگي هاي عمومي خانواده انتروباکترياسه مي باشد. تخمير کربوهيدرات توسط سالمونلا همراه با توليد گاز و اسيد مي باشد. سالمونلا مانيتول، آرابينوز، گلوکز، دولسيتول، سوربيتول و مالتوز را تخمير مي کند اما ساليسين، آدنيتول، لاکتوز و ساکارز را تخمير نمي کند ولي سالمونلا کلراسوئيس و تعدادي از سويه هاي سالمونلا تايفي، قادر به تخمير آرابينوز نيستند. سالمونلا کلراسوئيس، سالمونلا پولروم، برخي از سويه هاي سالمونلا پاراتايفي و تقريبا تمام سويه هاي سالمونلا تايفي قادر به تخمير دولسيتول نمي باشند. سالمونلا گاليناروم، برخي از سروتايپ هاي سالمونلا تايفي موريوم، سالمونلا تايفي و سالمونلا دابلين هنگام تخمير کربوهيدرات، گاز ايجاد نمي کند. برخي از سويه ها قادر به تخمير ساکارز، رافينوز و لاکتوز هستند، اين ويژگي هاي غير عادي بدليل وجود پلاسميد است. اکثرا سالمونلا آريزونه واجد فعاليت بتاگالاکتوزيداز مي باشد و لاکتوز را يا به سرعت و يا به آهستگي تخمير مي کند. بيشتر سويه هايي که قند هاي خاص را تخمير ميکنند، اين عمل را با شدت بالا انجام مي دهند و در آب پپتون دار در دماي 37 درجه سانتي گراد و در مدت زمان 6 تا 10 ساعت، اسيد توليد مي کنند. ممکن است سويه هاي غير تخمير کننده در اثر چهش به تخمير کننده تبديل شوند و بعد از گذشت چند روز اسيد ايجاد کنند و امکان دارد با ساير سالمونلا ها که تخمير کننده هستند، اشتباه گرفته شوند. برخي از سويه ها داراي نقص در فرايند جذب قند هستند و اسيد را در طول مدت 10 الي 20 ساعت ايجاد مي کنند(4).
1-2-4، طبقه بندي سالمونلا
طبقه بندي سالمونلا بسيار دشوار است، به علت اينکه از گونه هاي متععدي تشکيل شده است. معمولا گونه هاي سالمونلا را بر اساس ويژگي هاي بيوشيميايي، اپيدميولوژي، ميزبان و آنتي ژن هاي O، H و Vi طبقه بندي مي شوند. براي اولين بار در سال 1929 ميلادي طبقه بندي سالمونلا توسط کافمن صورت گرفت که توسط وايت اين طبقه بندي تکميل گرديد. بر اساس اين طبقه بندي، سروتايپ هاي سالمونلا در يک گونه منفرد قرار گرفت. طبقه بندي ديگري که وجود دارد،ادواردز-اوينگ26 مي باشد که سالمونلا را در سه گونه ي سالمونلا تايفي، سالمونلا کلراسوئيس و انتريتيديس و صد ها سروتايپ طبقه بندي مي کند(4و10).
طبقه بندي سومي که براي سالمونلا وجود دارد، بر اساس هيبريداسيون DNA27 مي باشد. که بر اساس آن جنس سالمونلا شامل دو گونه ي سالمونلا بونگوري و سالمونلا انتريکا مي باشد. در اين طبقه بندي اکثر پاتوژن هاي انسان در گونه ي انتريکا جاي گرفته اند.
سالمونلا انتريکا به شش زير گونه تقسيم مي شودکه شامل: سالمونلا انتريکا، سالمونلا سالاما، سالمونلا آريزونه، سالمونلا دي آريزونه، سالمونلا هونته و سالمونلا انتريتيديس مي باشد(5).
جدول1-1، ويژگي هاي بيو شيميايي سالمونلا
زيرگووه گونه
ويژگي
123a3b456انتريکاسالامهآريزونهدي آريزونههونتهبونگوريانديکاONPG–++-+متغييرهضم ژلاتين-++++-+مصرفD تارتارات+——مصرف مالونات-+++—تخمير دولسيتول++—+متغييرتخمير لاکتوز—+–تخمير ساليسين—-+–تخمير سوربيتول++++++-تخمير Dگالاکتورونات–++++گاماگلوتاميل ترانسفراز++-++++تاژکدو فازيدو فازيتک فازيدو فازيتک فازيتک فازيدو فازيرشد در حضورKCN—-+++
جدول 1-2، طبقه بندي نوين سالمونلا و ميزان سروتايپ ها در زير گونه ها(1, 8, 9)
اسم گونهميزان سرو تايپ در سال 2000 ميلاديميزان سرو تايپ در سال 2001 ميلاديميزان سرو تايپ در سال 2002 ميلاديالف- گونه سالمونلا انتريکا
1-سالمونلا انتريکا زير گونه انتريکا
2-سالمونلا انتريکا زير گونه سالامه
3-سالمونلا انتريکا زير گونه آريزونه
4-سالمونلا انتريکا زير گونه دي آريزونه
5-سالمونلا انتريکا زير گونه هونته
6- سالمونلا انتريکا زير گونه انديکا
ب- گونه بونگوري
جمع کل2469
1610
497
94
325
69
12
21
26282491
1624
499
95
329
69
13
21
26502509
1636
501
95
331
70
13
30
2668
1-2-5، آنتي ژن هاي سالمونلا
الف) آنتي ژن O
آنتي ژن O در برابر الکل و حرارت مقاوم است و در سالمونلا 67 انتي ژن O وجود دارد که با عدد نشان داده مي شود. آنتي ژن O مي تواند حرارت جوش را به مدت دو ساعت و نيم تحمل کند اما آنتي ژن فلاژل و آنتي ژن فيمبريه در اين درجه حرارت نابود مي شوند و قادر به تحمل آن نيستند. خاصيت آنتي ژن O بوسيله ليپوپلي ساکاريد28 که در ديواره باکتري هاي گرم منفي وجود دارد ايجاد مي شود.
بدليل هيدروفيل بودن آنتي ژن O در محلول نمکي0.85% NaCl، يک سوسپانسيون يکنواخت ايجاد مي کند.آنتي ژن O مي تواند در درجه حرارت 37 درجه سانتي گراد اتانول 96 درصد به مدت زمان چهار ساعت تحمل کند اما فرمالين 0.2% باعث غير فعاسازي آنتي ژن O ميشود. (2و3).
ب)آنتي ژن فلاژلي يا آنتي ژن H
آنتي ژن H در برابر الکل و حرارت حساس مي باشد و در درجه حرارت 100 درجه سانتي گراد به مدت زمان سي دقيقه همه ي فلازل ها از باکتري جدا مي شود. اين فرايند جدا شدن فلاژل ها از باکتري در دماي 60 درجه سانتي گراد آغاز مي شود اما اين فلاژل هايي که از باکتري جدا مي شوند، سيستم ايمني را تحريک مي کنند. آنتي ژن H يکي ديگر از آنتي ژن هاي سالمونلا مي باشد که اين آنتي ژن مربوط به فلاژل باکتري مي باشد. هنگاميکه که ما سوسپانسيون باکتري را به مدت دو نيم ساعت بجوشانيم اين خاصيت ايمني زايي باکتري از بين مي رود اما اگر در دماي پايين تر از دماي جوش قرار گيرد خاصيت اگلوتيناسيون آنتي ژن از بين رفته اما قدرت آنتي ژن از بين نمي رود (2و3).
آنتي ژن فلاژلي دو نوع است که عبارت است از : 1) آنتي ژن فلاژلي فاز يک(H?) 2) آنتي ژن فلاژلي فاز دو(H?).
آنتي ژن H? با حروف لاتين نشان داده مي شود و از حرف a تا حرف z ميباشد. به علت اينکه تعداد آنتي ژن H? بسياز بيشتر از 25 مي باشد، ساير آنتي ژن هاي H با اضافه کردن عدد به حرف Z مشخص مي شود. آنتي ژن H? به صورت عدد از 1 تا 12 نشان داده مي شود.تعداد آنتي ژن H?، 93 عدد مي باشد (3).
ج) آنتي ژن K يا آنتي کپسولي
سه نوع آنتي ژن کپسولي در سالمونلا وجود دارد که شامل: آنتي ژن M، آنتي ژن Vi و آنتي ژن 5
آنتي ژن M:
آنتي ژن M شامل کولانيک اسيد است. آنتي ژن M باعث ايجاد کلوني هاي مخاطي مي گردد. آنتي ژن M پلي ساکاريد هاي خارج سلولي مي باشد. مکانيسم جلوگيري از آگلوتيناسيون به وسيله آنتي سرم عليه O، شبيه مکانيسم عمل آنتي ژن Vi مي باشد. خصوصيت آنتي ژن M با آنتي ژن Vi تفاوت دارد.برخي از آنتي ژن هاي کپسولي اشرشياکلي (مثل: K?? و K??) و K? و K? کلبسيلا با آنتي ژن M سالمونلا واکنش متقاطع29 دارند. براي تعيين آنتي ژن M، کلوني ها حالت لعابي پيدا مي کند و به کشت باکتري سرم ضد آنتي ژن M اضافه مي کنيم که مي توان از آزمايش تورم کپسولي استفاده نمود(3).
آنتي ژن Vi:
آنتي ژن Vi يک پلي ساکاريد کپسولي مي باشد و از واحد هاي هموپليمرN- استيل گالاکتوز آمينورونيک اسيد تشکيل شده است که با پيوند 1 به 4 بهم متصل شده اند و کربن شماره ي 3 آن استيله مي باشد. هنگاميکه از خون بيماران مبتلا به تب روده اي، سالمونلا انتريکا سرووار تايفي جدا شود، اين سالمونلا ها در برابر آنتي سرم O? آگلوتينه نمي شوند. بدليل آنکه اين آنتي ژن براي موش داراي قدرت بيماريزايي بيشتر مي باشد به آن آنتي ژن حدت30 گفته مي شود.
سويه هايي که داراي آنتي ژن Vi مي باشند در برابر آب اکسيژنه حساس اند و به همين علت دانشمندان معتقند که آنتي ژن Vi در مکانيسم فاگوسيتوز نوتروفيل ها اختلال ايجاد نمي کند بلکه در برابر عمل انفجار اکسيداتيوي که در داخل نوتروفيل ها رخ مي دهد، مقاوم است. آنتي ژن Vi ميزان تثبيت C? در سطح سالمونلا تايفي کاهش مي دهد(زهرايي سال1378 Murray, Rosenthal et al. 2013). به علت آنکه آنتي ژن Vi مانع از عمل آگلوتيناسيون به وسيله آنتي سرم ضد آنتي ژن O مي شود، براي حذف آنتي ژن Vi، بايد باکتري را در دماي صد درجه سانتي گراد( دماي جوش) به مدت يک ساعت جوشاند(1 و 3).
آنتي ژن 5:
در ابتدا اين آنتي ژن به عنوان آنتي ژن O شناسايي شد و اين آنتي ژن داراي تفاوت هايي با ساير آنتي ژن هاي پيکري است.
کافمن نشان داد که اين آنتي ژن در برابر کلريدريک اسيد حساس بوده و در مجاورت آن تخريب مي شود و ويژگي آگلوتيناسيون آنتي ژن 5 در درجه حرارت 120 درجه سانتي گراد از بين مي رود که اين ويژگي بر خلاف آنتي ژن O? مي باشد.اين آنتي ژن در برابر الکل مقاوم است که اين ويژگي مشابه آنتي ژن O? مي باشد.آنتي ژن 5 در ارتباط با بيماريزايي سروتايپ ها بي تاثير است، به عنوان مثال سالمونلا انتريکا سرووار تايفي موريوم که فاقد آنتي ژن 5 مي باشد براي موش به شدت بيماريزا است. مي توان آنتي سرم ضد آنتي ژن 5 را بوسيله کشت فرمالين اشکال بدون فلاژل با کشت حرارت ديده سالمونلا پارا تايفيB بدست اورد(11, 12).
د) آنتي ژن هاي فيمبريه اي
اکثر سروتايپ هاي سالمونلا داراي جايگاهي براي آنتي ژن فيمبريه هستند و فيمبريه توليد مي کنند. با توجه به بررسي هايي که بر روي سالمونلا انتريتيديس و سالمونلا تايفي موريوم صورت پذيرفت، اطلاعاتي در مورد فيمبريه ي سالمونلاها بدست آمد. آنتي ژن فيمبريه اي در برابر فرمالدئيد0.1-0.2 ثابت مي شود که اين ويژگي مشابه آنتي ژن فلاژل مي باشد. برخي از آنتي ژن هاي فيمبريه اي داراي خاصيت پوشانندگي آگلوتيناسيون O وH مي باشند، اين ويژگي باعث مي شود که هنگاميکه از سالمونلايي که در مرحله اول فيمبريه قرار دارد، آنتي بادي ضد فيمبريه جدا شود و از اين آنتي بادي استفاده شود، باعث ايجاد واکنش متقاطع و گيج کننده اي مي شود. براي آنکه اين واکنش صورت نگيرد بايد از کشت هايي براي تهيه سوسپانسيون استفاده شود که در مرحله غير فيمبريه اي باشند. فيمبريه اگر به مدت 30 دقيقه در حرارت 100 درجه سانتي گراد قرار گيرد از باکتري جدا مي شود ولي در دماي 121 درجه سانتي گراد به مدت سي دقيقه قرار گيرد، غير فعال مي شود(5).
1-2-6، عوامل دخيل در بيماريزايي در سالمونلا
سالمونلا داراي عوامل بيماريزايي متعددي مي باشد که شامل: انتروتوکسين، سيتوتوکسين، اندوتوکسين، سيدروفور، آنتي ژن هاي سطحي و غيره مي باشد و اين عوامل در سروتايپ هاي مختلف سالمونلا نقش مختلفي در بيماريزايي سالمونلا در ميزبان هاي مختلف بر عهده دارند مثلا سالمونلا تايفي موريوم در ميزبان طبيعي خود، موش، بيماري هايي شبيه حصبه ايجاد مي کند ولي در انسان ، گاستروانتريت خود محدودشونده31 ايجاد مي کند در حاليکه سالمونلا تايفي حتي به صورت خوراکي در حيوانات ايجاد بيماري نمي کند و تنها در انسان بيماري ايجاد مي کند. اين باکتري انگل اختياري داخل سلولي32 مي باشد. بقاء سالمونلا داخل سلول هاي ميزبان به دليل پاسخ هاي متفاوت سيستم اينمني ميزبان هاي مختلف سالمونلا در برابر اين باکتري مي باشد(3).
الف) سيتوتوکسين
فعاليت سيتوتوکسين تنها در عصاره باکتري ديده مي شود، اين ويژگي بدليل وابستگي توکسين به غشاي خارجي باکتري مي باشد. ميزان توليد سيتوتوکسين توسط سروتايپ هاي مختلف سالمونلا، متفاوت مي باشد. سروتايپ تايفي کمترين ميزان و سروتايپ هاي انتريتيديس و کلراسوئيس بيشترين ميزان توکسين را توليد مي نمايند. سيتوتوکسين در سلول هاي يوکاريوتي باعث مهار سنتز پروتئين مي گردد. درانتريت سالمونلايي تخريب سلول هاي پوشش روده ديده مي شود که احتمال داده مي شود اين تخريب توسط سيتوتوکسين سالمونلا ايجاد شود. عملکرد سيتوتوکسين در بيماريزايي سالمونلا هنوز بطور کامل معلوم نمي باشد اما احتمال داده مي شود اين سم باعث ايجاد تغييراتي در غشاي سلولي که مي شود که موجب مختل شدن عبور و مرور انتخابي مولکول ها از غشاي سلولي مي گردد که اين عملکرد در نهايت باعث نکروز شدن انتروسيت ها مي شود. اسيب بافتي ناشي از سيتوتوکسين باعث سهولت در تهاجم سالمونلا مي شود(3،10 ).
ب) اندوتوکسين
علامت هايي که در حيوانات آزمايشکاهي نظير موش در اثر تزريق اندوتوکسين ايجاد مي شود مشابه علايمي است که در اثر سپتمي سمي ناشي از سالمونلا ايجاد مي گردد. علامت هايي که در اثر اندوتوکسين سالمونلا ايجاد مي شود نظير کاهش فشار خون، لکوپني و در نهايت لکوسيتوز، شوک، اسيدوز و تب مي باشد. عامل اصلي سميت اندوتوکسين، ليپيد A موجود در غشاي خارجي باکتري هاي گرم منفي مي باشد. حساسيت انسان در برابر اندوتوکسين از ساير موجودات زنده بسياربالاتر مي باشد و اين بدليل آن مي باشد که بروز حالت تحمل در برابر اندوتوکسين بدليل افزايش آهسته درجه حرارت از بين مي رود. سلول هاي مختلفي از بدن مثل پلاکت ها، مونوسيت ها، سلول ها، ماکروفاژها و نوتروفيل ها تحت تاثير اندوتوکسين قرار گرفته و موادي از اين سلول ها آزاد مي شود مثل اينترلوکين هشت، آنافيلاتوکسين، اينترلوکين يک، اينترلوکين شش و فاکتور نکروز دهنده تومور33 مي باشد که هريک از اين مواد برروي اندام هاي بدن تاثير مي گذارد(3).
ج) انتروتوکسين
توکسين حساس به حرارت34 که نوسط اشرشيا کلي و ويبريو کلرا توليد مي شود توسط برخي از سويه هاي سالمونلا تايفي موريوم نيز توليد مي گردد که از نظر مکانيسم مشابه سم توليدي توسط ويبريو کلرا35 مي باشد و با فعال کردن ادنيلات سيکلاز و در نهايت باعث افزايش cAMP مي گردد. انتروتوکسيني که توسط برخي از سويه هاي سالمونلا تايفي موريوم توليد مي شود از لحاظ نياز به نفوذ نوتروفيل ها با کلراتوکسين متفاوت مي باشد در نتيجه ارتباطي بين ميزان بيماريزايي سالمونلا تايفي موريوم و توانايي تحريک نفوذ نوتروفيل ها وجود دارد. اين باکتري باعث غالب شدن نوتروفيل ها در بين ساير لکوسيت ها در طي تهاجم در غشاي روده مي شود و با تهاجم نوتروفيل ها به باکتري، انتروتوکسين از باکتري آزاد مي گردد.انترو توکسين همراه با ديواره باکتري مي باشد و ماهيت پروتئيني دارد(13).
1-2-7. بيماري هاي ناشي از سالمونلا
بيماري هاي ناشي از سالمونلا که در انسان ايجاد مي شوند شامل: گاستروانتريت، سپتي سمي، تيفوئيد و انترو کوليت حاد مي باشد(4).
الف) حصبه
سالمونلابه انتهاي ديواره اپيتليال روده حمله مي کند و سپس به گره هاي لنفاوي روده منتقل مي شود، در اين گره هاي لنفاوي، سالمونلا توسط ماکروفاژها- مونوسيت ها و پلي مورفونوکلئوز36 بلعيده مي شود و سالمونلاهايي که توسط PMN ها بلعيده مي شود، از بين مي روند اما سالمونلاهايي که توسط ماکروفاژها بلعيده مي شوند در درون واکوئل آن ها تکثير يافته و ماکروفاژها به عنوان يک ناقل براي سالمونلا عمل مي کند و باعث انتقال سالمونلا به بافت هاي مختلف رتيکلواندوتليال مي شود. در نهايت اين ماکروفاژهاي آلوده به سالمونلا تخريب شده و سالمونلا آزاد مي شود و باعث ايجاد سپتي سمي مي شود. حصبه توسط دو سروتايپ تايفي و پاراتايفي ايجاد مي گردد(6).
علايم حصبه بعد از 7 تا 14 روز بروز مي کند و شامل: بي حالي، تب، بي اشتهايي، سرفه خشک، يبوست و سردرد مي باشد. در اين دو هفته از بيماري، گلبول هاي سفيد در حد نرماي بوده و سالمونلا در مدفوع وجود ندارد. در هفته دوم از بيماري، بيمار به شدت نا خوش است به اين دليل که سالمونلاها از ماکروفاژهاي آلوده آزاد مي گردد. روي بدن بيمار لکه هاي به قطر دو تا سه ميلي متر ديده مي شود که شايد اين ماکولوپاپولار شامل سالمونلا باشد(6).
هنگاميکه بيمار مبتلا به حصبه بهبود يابد در تمام طول زندگي در برابر تيفوئيد مقاوم خواهد بود.هنگاميکه بيماري به موقع درمان پيدا نکند، فرد مبتلا به حصبه وارد مرحله ي جديدي از بيماري مي شود که فرد مبتلا به سختي رنج مي کشد و داراي علايمي شامل: يبوست شديد، اسهال زرد رنگ و تب بالا مي باشد.
در هفته سوم از بيماري، فرد وارد مرحله تب روده اي شده و داراي علايمي مي باشد که شامل: بي حالي، کاهش شديد وزن بدن و ممکن است نفخ در ناحيه شکم نيز مشاهده شود. در هفته چهارم به تدريج علائم کم شده و دماي بدن بعد 7 تا 10 روز به حالت طبيعي باز مي گردد اما ممکن بعد از دو هفته که تب پايين آمد ساير علائم نيز دوباره بروز کنند. علايمي که حيات بيمار را تهديد مي کند در مرحله تب روده اي رخ مي دهد(6, 14, 15).
بيماري شبيه تب روده اي معمولا نسبت به حصبه داراي علائم خفيف تري مي باشد و داراي عوارض شديد نمي باشد. دوره ي بهبود بيماري شبه حصبه که توسط سروتايپ پاراتايفي ايجاد مي شود نسبت به حصبه کمتر مي باشد.
شديدترين عوارضي که طي بيماري ايجاد مي شود، سوراخ شدن روده و خونريزي مي باشد که معمولا در هفته سوم از بيماري ايجاد مي شود. خونريزي روده با علايمي چون: شوک، ديده شدن خون در مدفوع و افت ناگهاني فشار مي باشد. سوراخ شدن روده باعث ايجاد شرايط اوراژنسي مي شود و فرد بايد تحت مراقبت هاي ويژه قرار گيرد، اين وضعيت به دليل ورود محتويات روده به حفره شکمي طي سوراخ شدن روده کوچک يا بزرگ مي باشد(14, 15).
يکسري علائم غير معمول نيز وجود دارد که شامل: التهاب لوزالمعده، مننژيت، عفونت کليه يا مثانه، مشکلات رواني مثل توهم، سايکوز، ميوکارديت و عفونت ريوي مي باشد که تمام اين علائم آتيپيک مي باشد. اگر درمان صورت نگيرد ممکن است فرد مبتلا دچار مرگ شود ولي اکثر افراد در کشورهاي توسعه يافته با درمان فوري به سرعت درمان مي يابند(14-16).
سپتي سمي
سپتي سمي داراي علايمي است که شامل: باکتريمي، بي اشتهايي، کاهش وزن بدن، کم خوني، بزرگ شدن کبد و طحال و تب ناگهاني مي باشد. پس از تهاجم به ايلئوم در بيماران داراي کم خوني ممکن است عفونت به سمت سپتي سمي سوق داده شود. درمان آنتي بيوتيکي سپتي سمي شامل: سفترياکسون، سپيروفلوکساسين و سفوپرازون مي باشد و بايد از افراد مبتلا به سپتي سمي کشت خون انجام شود بدليل آنکه باکتري در داخل خون اين افراد مي باشد. ممکن است باکتريمي سبب عفونت در جاهاي غير عادي بدليل وارد شدن ارگانيسم به اندام هاي مختلف شود. همچنين باعث سپسيس نيز مي شود(6).
ب) گاستروانتريت
سالمونلا با توليد انتروتوکسين و تهاجم به ديواره ي روده باعث ايجاد علايمي چون استفراغ، اسهال و تهوع مي شود. بيشتر سروتايپ هاي سالمونلا مي توانند باعث ايجاد انتريت مي گردند.وجودPMN ها در مدفوع باعث اثبات هجوم باکتري به بافت ها شود اما بطور غير معمول سالمونلا از دستگاه گوارش به ساير اندام هاي بدن منتقل مي گردد.
سالمونلا از طريق محصولات دامي آلوده به انسان انتقال مي يابد و اين عفونت بين انسان و دام مشترک مي باشد و اين يک عفونت زئونوز مي باشد.
ممکن است علاوه بر فراورده هاي لبني آلوده به سالمونلا، آب شده به مدفوع يا ادرار حيوانات يا غذا از ديگر منابع انتريت ناشي از سالمونلا مي باشند(6).
ج) انترو کوليت
اين بيماري تظاهر عفونت سالمونلايي مي باشد. در ايالات متحده آمريکا، سالمونلا تايفي موريوم و سالمونلا انتريتيديس غالب هستند، اما انتروکوليت توسط هرکدام از 1400 سروتايپ گروه يک سالمونلا مي تواند ايجاد شود. 8 تا 48 ساعت پس از خورده شدن سالمونلا، تهوع، اسهال پر حجم، سردرد، استفراغ روي مي دهد و تعداد کمي گلبول سفيد در مدفوع ديده مي شود. تب خفيف، شايع است ولي دوره بيماري 2 تا 3 روز پايان مي پذيرد.
ضايعات التهابي در روده کوچک و روده بزرگ وجود دارد. باکتريمي غير شايع است( 2 تا 4 درصد) به غير از مواردي که بيمار داراي نقص سيستم ايمني است. نتيجه کشت خون منفي است ولي نتيجه کشت مدفوع براي سالمونلاها مثبت بوده و ممکن است تا چند هفته پس از رفع علائم باليني مثبت باقي بماند(4).
1-2-8. اپيدميولوژي سالمونلا
سالمونلا باعث مسوميت هاي غذايي، حصبه، سپتي سمي و انتروکوليت مي شود و از طريق دهاني وارد بدن انسان و ساير حيوانات مي شود(15, 17, 18).


پاسخ دهید