تست جذب توئين
مهم ترين تست فيزيولوژيکي براي افتراق گونه هاي مالاسزيا ، تست آسيميلاسيون چربي يا جذب توئين ) T80 و T60 ، T40 ، T20 ) است .
واکنش اوره آز
اين محيط شامل اوره و معرف فنل رد است . فقط مالاسزيافورفور و مالاسزيا پاکي درماتيس توانايي توليد آنزيم اوره آز را دارند اما بفيه مالاسزيا اوره آز منفي هستند (87) .
رشد روي محيط ديکسون آگار اصلاح شده در 3 درجه دمايي 32، 37 و 40 درجه سانتي گراد
تقريباً تمام گونه ها در 32 و 37 درجه سانتي گراد رشد مي کنند اما فقط گونه هاي مالاسزيا فور فور،مالاسزيا پاکي درماتيس ،مالاسزيا سمپودياليس ،مالاسزيا اسلوفيه ،مالاسزيا درماتيس در 40 درجه سانتيگراد قادر به رشد کردن هستند (55).
روشهاي مولکولي
روش هاي فنوتيپي که توضيح داده شد روش هايي هستند که بصورت رايج براي شناسايي و افتراق گونه ها استفاده مي شود. در سال هاي اخير روشهاي مولکولي پيشرفت هاي زيادي داشته اند و به خاطر مزايايي که دارند، جايگزين روش هاي مورفولوژيکي و فيزيولوژيکي شده اند. روش هاي فنوتيپي وقت گير و چند مرحله اي بوده و به تکنيکهاي آزمايشگاهي زيادي نياز دارند. علاوه بر اين به علت تشابهاتي که در خصوصيات فيزيولوژي و مورفولوژي بعضي مثل مالاسزيا فورفور، مالاسزيا سمپودياليس و مالاسزيا اسلوفيه وجود دارد (40) و همچنين با مشاهده استرين هاي مالاسزيا با خصوصيات فيزيولوژيکي غير معمول (29و30)، استفاده از اين روش ها در تمايزگونه ها ابهام و سردرگمي بوجود مي آورد (19و41).
مطالعات زيادي وجود دارند که نشان دهنده اختلاف نتايج روش هاي فنوتيپي و کشت با روش هاي مولکولي است. از جمله مطالعه Makimura که در سال2000 انجام شد ، 46 ايزوله باليني را ابتدا با روش هاي فنوتيپي و سپس باسکوئنسينگ ناحيهITS-1 شناسايي کرد. در روش هاي فنوتيپي استفاده شده، 46 ايزوله بعنوان مالاسزيا فورفور شناسايي شدند ولي باسکوئنسينگ ناحيه ITS-1 از ، 22 تا از 46 ايزوله، مالاسزيا سمپودياليس و5 تا مالاسزيا اسلوفيا شناسايي شدند (27).
در مطالعه ديگري که در سال 2000، Nakabayashi و همکاران از روش کشت براي تشخيص گونه ها در افراد سالم و بيمار (پيتريازيس ورسيکالر و سوريازيس) استفاده کرد، نتايج به اين صورت بودکه در افراد سالم و بيمار، مالاسزيا گلوبوزا فراوان ترين ايزوله بود ولي مطالعات ديگر با استفاده از روش هاي تشخيصي مولکولي مثل Nested-PCR و Real-time روي افراد سالم و بيمار (پيتريازيس ورسي کالر، سوريازيس و درماتيت آتوپيک)، نشان دادندکه فراوان ترين ايزوله مالاسزيا رستريکتا و مالاسزيا گلوبوزا بودند (72و81). تفاوت بين روش هاي مولکولي و تکنيک هاي کشت نشان دهنده خطاي در کشت است که علت آن مي تواند به خاطر برداشت آرتي فکت از کشت به جاي نمونه باشد و يا اينکه محيط کشت استفاده شده به طور استاندارد و دقيق ساخته نشده باشد (27).
از ديگرمعايب روش هاي فنوتيپي اين است که اجزاي علم رده بندي را در بر نمي گيرند و با استفاده از اين روش ها ارتباط ژنتيکي بين گونه ها را نمي توان تعيين کرد. بنابراين استفاده از روش هاي مورفولوژي و فيزيولوژيکي رايج براي تشخيص گونه هاي مالاسزيا باعث محدوديت در تشخيص و طبقه بندي گونه هاي جديد مي شود. در سال هاي اخير براي غلبه بر اين محدوديت ها و درک بهتر اپيدميولوژي و اکولوژي گونه هاي مالاسزيا و نيز ارتباط آنها با بيماري ها استفاده از روش هاي مولکولي مختلف رايج شده است (27و42و43و79) که شامل، Nested-PCR ،PFGE ، DGGE، RFLP، Tflp، SSCP، RAPD، AFLP، Real-time PCR، Sequence مي باشند (70و71). بطور کلي براي تشخيص ارگانيسم ها با استفاده از PCR، به نواحي هدف DNA مناسب که لوکوس يا مارکر ژنتيکي ناميده مي شوند، نياز است.
مارکرهاي ژنتيکي مختلف شامل کمپلکس ژني rDNA هسته ايي، ژن کيتين سنتاز 2 (Chs-2) و ژن زير واحد يک RNA پلي مراز اخيرا به منظور شناسايي گونه هاي مختلف مالاسزيا استفاده مي شوند (25و82). مطالعات زيادي نشان مي دهند که از نواحي 1ITS-1، ITS-2، 2IGS-1 و دومنهاي D (D1 و D2) و زير واحد بزرگ DNA ريبوزومي که در کمپلکس ژني rDNA قرار دارند، مي توان بعنوان مارکرهاي ژنتيکي معتبر براي شناسايي گونه هاي مالاسزيا استفاده کرد (63).
توالي يک مارکر ژنتيکي در گونه هاي مختلف يک جنس قارچي، بايد به اندازه کافي با هم فرق داشته باشند، تا بتوان از آنها براي شناسايي اختصاصي گونه ها استفاده کرد. ولي اختلافات اين مارکرها در داخل يک گونه جزئي است يا اصلا وجود ندارد. در مقابل به منظور شناسايي استرين ها، اختلاف قابل توجهي در توالي هر مارکر ژنتيکي داخل يک گونه وجود دارد.
کمپلکس ژني rDNA
کمپلکس ژني rDNA يک کمپلکس چند نسخه اي (Multi copious) است که در تمام ميکروارگانيسم ها وجود دارد. توالي هر نسخه مشابه نسخه هاي ديگر در داخل آن فرد يا گونه است. جزئيات ساختاري اين کمپلکس در گروه هاي مختلف ارگانيسم هاي يوکاريوتي ممکن است اندکي متفاوت باشد اما ساختمان تيپيک اين کمپلکس متشکل از واحدهاي تکراري (unit repeat) است که هر واحد از ژنهاي کد کننده 18S ، 5.8S و 28S و نواحي غير کد کننده فاصله انداز رونويسي1 شامل نواحي ITS و2ETS تشکيل شده است. واحدهاي تکراري، توسط نواحي فاصله انداز داخلي3 از هم جدا مي شوند (50). کمپلکس ژني rDNA داراي بخش هاي مختلف محافظت شده و متغير است که بسته به اهداف تشخيصي يا تحقيقي مي تواند براي شناسايي ميکروارگانيسم ها در حد جنس وگونه يا فوق جنس و زير گونه بکار رود. اين نواحي مارکرهاي مناسبي براي تعيين جايگاه تاکسونوميک بيشتر قارچ ها ازجمله مالاسزياها مي باشد. (16).
تعيين توالي ناحيه ITS، در مطالعات مختلف جهت شناسايي قارچ هاي مختلف از جمله درماتوفيت ها، گونه هاي کانديدا، قارچ هاي سياه، گونه هاي مالاسزيا و غيره مورد استفاده قرار گرفته است و شايد بتوان گفت هيچ مارکري در ميان قارچ ها به اندازه مارکر ITS تعيين توالي نشده است (50).
ناحيه ITS به يک قطعه DNA فاقد عملکرد نسبت داده مي شود که بين نواحي 18S و 28S در rDNA قرار دارد. درطول بلوغ rRNA ، ITS و ETS جدا مي شوند و بعنوان محصولات فرعي فاقد عملکرد به سرعت از بين مي روند. از ناحيه ITS، بعلت تنوع توالي نوکلئوتيدي بالائي که دارد، مي توان براي افتراق گونه ها و حتي تشخيص داخل گونه ايي استفاده کرد. بنابراين با مقايسه سکانس ناحيه ITS بطور وسيعي در تاکسونومي و فيلوژني قارچ ها مي توان استفاده کرد. اين امر بعلت تعداد کپي هاي زياد ژن rRNA است که در نتيجه با مقدار کم DNA هم مي توان اين ناحيه را تکثير کرد (50و51). براي مثال از ناحيه ITS-1 براي تمايز 7 گونه مالاسزيا با رنج 70-26? اختلاف در توالي نوکلئوتيدي، استفاده شد. همچنين اختلافات داخل گونه اي با رنج 8/2-7/1? اختلاف در توالي نوکلئوتيدي ناحيه ITS-1 در گونه هاي مالاسزيا فورفور، مالاسزيا سمپودياليس، مالاسزيا اسلوفيا و مالاسزيا پاکي درماتيس شناسايي شدند (51). بعد از سال 1996با استفاده از اختلاف در توالي ITS-1، گونه مالاسزيا ژاپونيکا معرفي شد(70). Makimura و همکاران درمطالعه ايي که روي گونه هاي مالاسزيا در سال 2000 بر اساس توالي ITS-1 انجام دادند، 22 ايزوله از مالاسزيا سمپودياليس را به 3 گروه تقسيم بندي کردند که 84? ايزوله ها به گروه يک تعلق داشت (63).
ژن chs-2
آناليز ژن Chs-2 نشان مي دهد که اين ژن توانايي تمايز 7 گونه مالاسزيا را دارد، با توجه به اينکه 95? شباهت در سکانس گونه ها در اين ژن وجود دارد (56). با استفاده از ژن Chs-2 در نمونه هاي باليني مالاسزيا پاکي درماتيس از گربه ها و سگها، 4 ژنوتيپ تشخيص داده شده است (A,B,C,D) که به ضايعات پوستي يا اوتيت مربوط مي شوند. اخيرا براي ژنوتيپ مالاسزيا پاکي درماتيس از آناليز توالي مولتي لوکوس(ITS-1, LSU و ژن Chs-2) استفاده شد که با استفاده از اين توالي 3 ژنوتيپ (A، B و C) براي آن تعريف شد (20). 2 تا از اين ژنوتيپ ها مربوط به ضايعات پوستي بودندکه مخمرها در اين موارد فعاليت ففوليپاز بالائي داشتند. ولي ژنوتيپ سوم از پوست افراد سالم که فعاليت فسفوليپازپائين داشتند بدست آمد (21و29). توالي مولتي لوکوس همچنين براي شناسايي و تمايز گونه هايي که با استفاده از روش هاي مورفولوژيکي وفيزيولوژيکي به سختي شناسايي مي شوند، استفاده مي شود (29و30).
هدف ا ز اين طرح تعيين گونه هاي مالاسزيا جدا شده از بيماران مبتلا به پيتريازيس ورسيکالر به کمک محيط کشت کروم آگار اصلاح شده و تاييد آن به روش PCR در شهر اهواز مي باشد.با توجه به توزيع متفاوت گونه هاي مالاسزيا در نواحي مختلف جغرافيايي وهمچنين حساسيت متفاوت گونه هاي مختلف به داروهاي ضد قارچي،با شناسايي دقيق گونه هاي مالاسزيا،درمان بيماري هاي مرتبط با آن تسهيل خواهد شد(31).
روشهاي تکثير نوکلئيک اسيد در آزمايشگاه
(Nucleic acid multiplication method in lab):
1) تکثير سيگنال
2) تکثير پروب
3) تکثير هدف: شامل تکنيک PCR است(57).
واکنش زنجيره اي پلي مراز(PCR)
پيشرفت هاي 2 دهه اخير در زمينه بيولوژي مولکولي موجب ارتقاء کارايي و تکامل هرچه بيشتر آزمايش هاي وابسته به DNA در علوم باليني گرديده است. يکي از مهمترين اين پيشرفت ها در زمينه بيولوژي مولکولي که در عين حال کاربرد تشخيصي نيز دارد، PCR مي باشد که علاوه بر سريع نمودن آزمايش هاي وابسته به DNA در موارد متعدد موجب افزايش حساسيت اين گونه آزمايش ها گرديده است. به طور کلي PCR به روش ازدياد مقادير جزئي DNA يا RNA (ازدياد RNA با روش RT-PCR امکانپذير است) تا حد مشاهده آنها توسط روش هاي ساده و رايج آزمايشگاهي اطلاق مي شود.
قابليت PCR در ازدياد اسيدهاي نوکلئيک موجود در نمونه مورد آزمايش، موجب شناسايي سريع و اختصاصي نوع سلول يا ميکروارگانيسم مورد نظر در نمونه مذکور مي گرددکه اين ويژگي علاوه بر بکارگيري PCR در تشخيص آزمايشگاهي بيماري ها،آن را بعنوان ابزاري مطمئن و حساس در زمينه پژوهش هاي علمي مطرح مي سازد. از زمان معرفي PCR در سال 1988، بکارگيري آن در تحقيقات بيولوژيکي پايه و کاربردي، موجب ايجاد تغييرات اساسي گرديده است. اين تکنيک آزمايشگاهي براي نخستين بار توسط کري موليس 2 در سال 1988 معرفي گرديد. روش PCR تنها براي توالي هايي مورد استفاده قرار مي گيرد که از قبل شناخته شده باشد. همچنين قطعات بسيار بزرگ توانايي تکثير با PCR را ندارند(72).
مواد مورد نياز جهت انجام تکنيک PCR
آنزيم DNA پلي مراز3 : براي تکثير يک قطعه DNA نياز به DNA پلي مراز است. در ابتداي طراحي PCR
از آنزيم DNA پليمراز E.coli استفاده شد ولي اين آنزيم به حرارت حساس بود، لذا پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دماي94 درجه سانتي گراد، افزودن آنزيم تازه به محيط لازم بود. يکي از مهمترين کشفيات در اين زمينه استفاده از آنزيم Taq پليمراز بود. اين آنزيم از باکتري Termus aquaticus که يک ميکروارگانيسم آبزي در آب هاي گرم است، جداسازي شده است. اين آنزيم نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتي در حرارت بالا فعاليت بهتري دارد. يک مزيت بسيار مهم ديگر Taq پلي مراز افزايش حساسيت و دقت PCR است. معمولا حدود 5/1-1 واحد آنزيمTaq پليمراز در يک واکنش 50 ميکروليتري استفاده مي شود. غلظت هاي بالاتر ممکن است باعث سنتز محصولات غير اختصاصي شود.
پرايمرها4 : DNA پليمراز براي شروع سنتزنياز به پرايمرها دارد. پرايمرها قطعات DNA بازسازي شده جهت تکثير از روي DNA الگو مي باشند. پرايمرها بصورت مکمل با بازهاي DNA الگو طراحي مي شوند. ايده آل آن است که پرايمرها تعداد مساوي از هر 4 باز را داشته باشند. پرايمرها در واکنش PCR در دو سوي توالي هدف متصل مي شوند و بدين ترتيب فعاليت آنزيم DNA پلي مراز شروع مي گردد. اتصال غير اختصاصي پرايمرها خصوصا در انتهاي ‘ 3 باعث توليد محصولات غير اختصاصي DNA مي شود. در طراحي پرايمرها چند عامل بايد مد نظر قرار گيرد:
– پرايمرها تعيين کننده قسمت قابل تکثير DNA باشند.
– براي هر PCR، دو پرايمر طراحي گردد.
– طول پرايمرها معمولا 30-15 نوکلئوتيد باشد.
– پرايمرها نبايد مکمل يکديگر باشند.

5dNTP:dNTP ها در واقع نقش سوبتراي آنزيم DNA پليمرازرا بر عهده دارند. وجود اين مولکول ها براي واکنش PCR بيار مهم و ارزنده مي باشد. اين مولکول ها يا بصورت مخلوط و يا حتي به اشکال جداگانه مورد استفاده قرار مي گيرند.
بافر مناسب: بافر PCR نقش مهمي در افزايش کارايي PCR و ممانعت از تجمع و اتصال مولکولهاي پروتئيني آنزيم Taq DNA پليمراز به يکديگر دارد. بافر PCR معمولا شامل تريس با PH= 8.3-8.8 و يک نمک است که معمولا، KCL, MgCL2 و يا آمونيوم سولفات است.
MgCL2: از اجزاء مهم وتاثير گذار واکنش PCR است که باعث افزايش و کارايي و بهينه کردن پرايمرها، توالي هدف، بافر و افزايش اتصال پرايمرها، جلوگيري از اتصال غير اختصاصي پرايمرها با توالي هاي غير هدف، افزايش فعاليت آنزيم Taq DNA پليمراز مي شود. يونهاي Mg?? با dNTP ها و پرايمرها و الگوي DNA تشکيل کمپلکس مي دهند. مقدار MgCL2 بستگي به پرايمر و DNA از 1 الي 10 ميلي مولار متغيراست.غلظت هاي کم MgCL2 منجر به کاهش محصولات PCR مي شود و غلظت هاي زياد آن موجب ايجاد محصولات غير اختصاصي مي گردد.
دستگاه ترموسايکلر 6: يکي از پيشرفت هاي عمده در زمينه PCR کشف دستگاه ترموسايکلر بود. ترموسايکلر در واقع بلوک هاي حرارتي قابل برنامه ريزي مي باشند که بطور اتوماتيک حرارت هاي لازم را براي مراحل سه گانه PCR توليد مي نمايد ضمن اينکه تعداد چرخه هاي مورد نياز براي انجام PCR و ازدياد DNA به طور اتوماتيک در اين دستگاه بوقوع مي پيوندد (72و57).
طراحي پرايمر

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

قواعد مشخصي براي اينکه بتوان يک جفت پرايمر موثر را با اطمينان انتخاب کرد وجود ندارد. در حال حاضر پرايمر بيش از هر عامل ديگري عامل موفقيت و شکست در يک واکنش PCRاست. بعضي قواعد راهنماي هاي مفيدي را در مورد طراحي آغازگر به ما ارائه مي کنند که ذيلا به آنها اشاره شده است:
– طول متوسط هر پرايمر بين 30-15 جفت باز باشد. پرايمر با طول کوچکتر اتصال غيراختصاصي را افزايش مي دهد و پرايمر بزرگتر سرعت هيبريداسيون را کم مي کند.
– مقدار C+G دو پرايمر با هم مشابه بوده و حدود 60-50? باشد.
– پرايمرها بايد از نظر مکمل بودن با هم کنترل شوند.
پرايمردايمريا آغازگردوتايي يک تکثيرمصنوعي است که اغلب در محصول PCR مشاهده مي شود وعبارت است ازيک قطعه دو رشته اي که طول آن تقريبا به مجموع دو پرايمر نزديک است وهنگامي مشاهده مي شود که يک پرايمرتوسط آنزيم پليمراز به روي پرايمر ديگرگسترش يابد. مکانيسم واقعي چگونگي تشکيل پرايمردايمربه درستي مشخص نيست. درهرحال چنانچه پرايمردايمر به عنوان مانعي مشاهده شود مي توان آن را تا حدودي با غلظت حداقل پرايمر وآنزيم کاهش داد.
– در انتهاي’ 3 پرايمر بايد حداقل C يا G قرار گيرد. در پرايمرهايي که توالي انتهاي’ 3 آنها غني از C+G است احتمال اتصال اشتباه افزايش مي يابد.
– نسبت چهار نوع نوکلئوتيد در پرايمر ها حتي المقدور يکسان باشد.
– پرايمرها به توالي تکرار شونده ختم نشوند.
– دماي Tm دو پرايمر نزديک هم باشد


دیدگاهتان را بنویسید