سپاسگزاري
به نام پادشاه پادشاهان گناه آمرز مشتي عذرخواهان
تقدير تشکر مي نمايم از تمامي دانش پژوهان، انديشمندان و فرهيختگان عرصه پرتلاطم علم و ادب که در وجود منورشان شمشير قلم با حرير کتاب آشتي نموده است و در حنجره شان فرياد نوع دوستي با مناجات مانوس گشته. به خصوص نهايت سپاس را دارم از استاد راهنما و مشاور انديشمند و فرهيختهي خود جناب آقاي دکتر مصطفي سعادت و دکتر ايرج سعادت که با تلاش بيدريغشان در خزان همواره تلاش نمودند تا راه راه بهار دانش را بر شاگرد حقيرشان فراهم نمايند. همچنين تشکر مي کنم از جناب آقاي دکتر رضا يوسفي که زحمت داوري اين پايان نامه را تقبل نمودند.
چکيده
بررسي ارتباط چندشکلي هاي ژنتيکي ژنهاي
GSTM1 ، GSTT1 و CAT با خطر اعتياد به مواد مخدر

به کوشش
محمدرشيد خليقينسب

خانواده ژني گلوتاتيون S ترانسفراز و کاتالاز از آنزيمهاي متابوليکي مهم در سم زدايي گونههاي فعال اکسيژن ميباشند. هدف از اين مطالعه، بررسي ارتباط چندشکليهاي ژنتيکي GSTM1، GSTT1 و CAT C-262T با استعداد ابتلاء به مواد مخدر هروئين، شيره، ترياک و شيشه ميباشد. در اين مطالعه مورد- شاهدي 708 نفر معتاد به مواد مخدر و 799 نفر سالم به عنوان گروه کنترل انتخاب شدند. براي تعيين ژنوتيپهاي نول GSTM1 و GSTT1 از روش multiplex-PCR و تعيين ژنوتيپهاي چندشکلي CAT C-262T از روش PCR- RFLP استفاده گرديد. نتايج نشان داد که فراواني ژنوتيپ هاي نول GSTM1 و GSTT1 در افراد معتاد به هروئين، شيره و شيشه نسبت به افراد سالم اختلاف معني داري ندارد. همچنين حذف همزمان هر دو ژن در افراد معتاد به هروئين، شيره و شيشه در مقايسه با گروه شاهد اختلاف معني داري را نشان نداد. فراواني ژنوتيپ نول GSTT1 در گروه معتادان به ترياک در مقايسه با افراد سالم به طور معني داري بيشتر بود (037/0P=، 39/2-02/1CI= 95%، 56/1OR=)، ولي ارتباط معناداري بين ژنوتيپ نول GSTM1 و خطر اعتياد به ترياک مشاهده نگرديد (052/0P=، 00/1-48/0CI= 95%، 69/0OR=). در بررسي ارتباط بين چندشکلي ژنتيکي CAT (C-262T) و خطر اعتياد به هروئين، شيره، ترياک و شيشه، اختلاف معني داري بين ژنوتيپهاي اين چندشکلي و اعتياد به هروئين، شيره و شيشه مشاهده نشد ولي نتايج نشان داد که فراواني ژنوتيپ TT از اين چندشکلي در افراد معتاد به ترياک به طور معني داري نسبت به افراد سالم بيشتر است (002/0P=، 40/6-49/1CI= 95%، 09/3OR=).
کليد واژه: اعتياد به مواد مخدر- پلي مورفيسم GSTM1- GSTT1- CAT –

فهرست مطالب

عنوان صفحه
فصل اول: مقدمه
1-1- اعتياد 2
1-2- گيرندههاي اپيوئيدي 4
1-3- متآمفتامين 6
1-4- علل گرايش به مواد مخدر6
1-5- کانون هاي پاداش و لذت در مغز6
1-6-ROS و کانال هاي L-Type کلسيمي7
1-7- ROS و آنزيم هاي آنتي اکسيدان8
1-8- گلوتاتيون S ترانسفراز8
1-9- ژن GSTM113
1-10- ژن GSTT1 14
1-11- ژنCAT 15
1-12- هدف 17
فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده
2-1- مطالعات صورت گرفته بر روي چند شکلي هاي ژنتيکي GSTM119
2-2- مطالعات صورت گرفته بر روي چند شکلي هاي ژنتيکي GSTT120
2-3- مطالعات صورت گرفته بر روي چند شکلي هاي تک نوکلئوتيدي CAT21
2-4- فرضيه23
عنوان صفحه
فصل سوم: روش انجام کار
3-1- نمونه گيري 25
3-2- دستگاه هاي مورد استفاده در پژوهش 25
3-3- استخراج DNA26
3-4- مواد مورد استفاده براي انجام PCR26
3-5- واکنش زنجيره اي پليمراز (PCR) 27
3-6- تعيين ژنوتيپ28
3-6-1- تعيين ژنوتيپ ژن هاي GSTM1، GSTT128
3-6-2-تعيين ژنوتيپ ژن CAT29
3-7- الکتروفورز 31
3-7-1- مواد مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز31
3-7-2- تهيه ي محلولهاي مورد استفاده جهت انجام الکتروفورز31
3-7-3- الکتروفورز ژن هاي GSTM1، GSTT1 و رنگ آميزي ژل32
3-7-4- الکتروفورز PCR-RFLP براي ژن کاتالاز و رنگ آميزي ژل33
3-8- تحليل آماري 34
فصل چهارم: نتايج
4-1- مشخصات افراد شرکت کننده در پژوهش 36
4-2- مقايسه چندشکليهاي ژنتيکي GSTM1 ،GSTT1 و CAT در دو گروه معتاد به هروئين و سالم36
4-3- مقايسه چندشکليهاي ژنتيکي GSTM1 ،GSTT1 و CAT در دو گروه معتاد به شيره و سالم39
عنوان صفحه
4-4- مقايسه چندشکليهاي ژنتيکي GSTM1 ،GSTT1 و CAT در دو گروه معتاد به ترياک و سالم43
4-5- مقايسه چندشکليهاي ژنتيکي GSTM1 ،GSTT1 و CAT در دو گروه معتاد به شيشه و سالم45
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري
5-1- بحث و بررسي نتايج در ژنهاي GSTM1 و GSTT1 و CAT 49
5-2- پيشنهادات 52
فهرست منابع53
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
جدول 1-1- GSTها سيتوزولي پستانداران 11
جدول 1-2- سوبستراهاي مناسب آنزيم گلوتاتيون S ترانسفراز انساني13
جدول 3-1- مواد مورداستفاده براي تهيه واکنش ميکس multiplex-PCR27
جدول 3-2- مواد مورداستفاده براي تهيه واکنش ميکس ژنCAT28
جدول 3-3- برنامه mulitiplex-PCR براي تکثير ژن هاي GSTM1، GSTT1 29
جدول 3-4- برنامه ي PCR براي تکثير ژن CAT30
جدول 4-1- اطلاعات جمعيت مورد مطالعه در دو گروه معتاد به هروئين و سالم37
جدول 4-2- توزيع فراواني ژنوتيپ‌ ژن‌هاي GSTT1 و GSTM1 در افراد معتاد به هروئين و سالم38
جدول 4-3- فراواني آللي و ژنوتيپي ژن کاتالاز در افراد معتاد به هروئين و سالم38
جدول 4-4- فراواني ژنوتيپ ها و الل هاي چندشکلي CAT-262 در افراد معتاد به هروئين و سالم39
جدول 4-5- اطلاعات جمعيت مورد مطالعه در دو گروه معتاد به شيره و سالم40
جدول 4-6- توزيع فراواني ژنوتيپ‌ ژن‌هاي GSTT1 و GSTM1 در افراد معتاد به شيره و سالم41
جدول 4-7- فراواني آللي و ژنوتيپي ژن کاتالاز در افراد معتاد به شيره و سالم41
جدول 4-8- فراواني ژنوتيپ ها و الل هاي چندشکلي CAT-262 در افراد معتاد به شيره و سالم42
عنوان صفحه
جدول 4-9- اطلاعات جمعيت مورد مطالعه در دو گروه معتاد به ترياک و سالم43
جدول 4-10- توزيع فراواني ژنوتيپ‌ ژن‌هاي GSTT1 و GSTM1 در افراد معتاد به ترياک و سالم44
جدول 4-11- فراواني آللي و ژنوتيپي ژن کاتالاز در افراد معتاد به ترياک و سالم44
جدول 4-12- فراواني ژنوتيپ ها و الل هاي چندشکلي CAT-262 در افراد معتاد به ترياک و سالم45
جدول 4-13- اطلاعات جمعيت مورد مطالعه در دو گروه معتاد به شيشه و سالم45
جدول 4-14- توزيع فراواني ژنوتيپ‌ ژن‌هاي GSTT1 و GSTM1 در افراد معتاد به شيشه و سالم46
جدول 4-15- بررسي تعادل هاردي- واينبرگ در جمعيت معتاد به شيشه و سالم براي ژن کاتالاز47
جدول 4-16- فراواني ژنوتيپ ها و الل هاي چندشکلي CAT-262 در افراد معتاد به شيشه و سالم47
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل 1-1- فراواني مصرف کننده گان الکل و مواد مخدر در 6 کشور مختلف3
شکل 1-2- ساختار گيرندههاي اپيوئيدي5
شکل 1-3- ROS و کانالهاي L-Type کلسيمي7
شکل 1-4- آنزيم هاي GST مسؤل کاتاليز کردن ترکيبات کارسينوژنيک و سايتوتوکسيک از طريق کنژوگه کردن آنها با گلوتاتيون مي باشند11
شکل 1-5- خانواده ي سوپر ژن گلوتاتيون-S- ترانسفراز12
شکل 1-6- شکل شماتيک ژن کاتالاز و جايگاه چندشکلي ژنتيکي مورد بررسي16
شکل 3-1- يک نمونه از آناليز multiplex-PCR و چند شکلي ژنتيکي دو ژن GSTM1 و GSTT1 بر روي ژل آگاروز 33
شکل 3-2- تعيين ژنوتيپ چندشکلي ژن کاتالاز بر روي ژل آگاروز34

فصل اول

مقدمه
1-1: اعتياد1

مصرف مواد مخدر يکي از خطرناک‌ترين پديدههاي جوامع بشري در عصرِ حاضر است. اعتياد در جهان ما چنان گسترش يافته است که به يک بيماري مزمن اجتماعي تبديل شده و امنيت اجتماعي را متزلزل ساخته است. بر طبق داده هاي رسمي 2/1 تا 2 ميليون ايراني با ميانگين سني 18سال معتاد به آمفتامين هستند. بيش از 11 ميليون از جمعيت کشور با مسئلهي اعتياد روبرو هستند. در طول 30 سالِ گذشته، جمعيت ايران با نرخ رشد سالانهي 8 درصدي، با بيماري خانمان سوز اعتياد دست و پنجه نرم کردهاند. اين آمار بيانگر اين است که تعداد نوجواناني که گرايش به مواد مخدر پيدا کرده اند؛ در حال افزايش بوده است(Afkari et al., 2013). متأسفانه امروزه گسترش و شيوع اعتياد بهحدي است که معضلات اجتماعي، جسماني و خانوادگي بسياري را موجب شده است .(Agha et al., 2008)
به طوريکه سازمان جهاني سلامت برآورد کرده بود که بيش از 2 ميليارد مصرف کنندهي الکلي، 3/1 ميليارد مصرف کنندهي تنباکو و 185 ميليون مصرف کنندهي داروهاي غيرِمجاز وجود داشته است. بنابراين جهتِ پرده برداشتن از سطح معضلاتي که پارهاي از کشورها با آنها درگير بودهاند نمودار ترسيمي شکل 1-1 را که بيانگر مصرف مواد مخدر و مقدار الکل مصرف شدهي اين گونه کشورها ميباشد به عينه دربرابر ديدگان حقيقت بين خوانندگان قرار ميدهيم .(Goldman et al., 2006)

شکل 1-1- فراواني مصرف کنندهگان الکل و مواد مخدر در 6 کشور مختلف

عواملي که در شيوع اعتياد نقش دارند عبارتند از:
* محيط: محيط از 3 طريق ميتواند در گرايش به سوء مصرف مواد مخدر نقش داشته باشد که عبارتند از:
* تجربههاي جديد زندگي
* فردي که حتي براي مدت طولاني از مصرف مواد دور بوده است، در محيط پاک يا اصطلاحاً خنثي قرار داشته است؛ ميتواند با قرار گرفتن در معرض محيطهاي آلوده به مصرف مواد مخدر دوباره به سمت اعتياد گرايش پيدا کند.
* تجربهي خوب مصرف مواد و تاثيرات روحي و رواني آن ميتواند باعث جذب دوبارهي افراد به استفاده از اينگونه مواد مخدر شود .(Caprioli et al., 2007)
* مصرف دارو2: مصرف سوء داروهايي مثل الکل و نيکوتين، منجر به تغيير در بيان ژن ها و تغييرات رفتاري افراد درگير با اين گونه مواد شدهاند.(Sinha et al., 2009)
* ژنتيک: مطالعه بر روي خانواده و دوقلوها نقش ژنتيک در اعتياد را تاييد کرده است.
مطالعاتي که بر روي خانوادهها و دوقلوها صورت گرفته است نشان ميدهد، که وابستگي به الکل، نيکوتين، حشيش و ديگر مواد مخدر غيرقانوني، تحت تاثير فاکتور هاي ژنتيکي بوده است .(Agrawal et al., 2008)
البته در ارتباط با تأثير عوامل ژنتيکي در مطالعه اي که توسط Tsuang و همکاران بر روي 3372 دوقلو در ويتنام انجام گرفت؛ تأثيرات مختلفي از عوامل ژنتيکي، محيط خانوادگي و غير خانوادگي بر روي داروهاي متعدد گزارش شد که بزرگترين ميزان تاثير سوء در مصرف مواد مخدر را عوامل ژنتيکي داشتهاند .(Tsuang et al., 1998)

1-2: گيرندههاي اپيوئيدي
اپياتها3از ترياک گرفته ميشوند، که تواناييِ اتصال به گيرندههاي اٌپيوئيديِ درونزا را دارند. از اين گيرندهها کاپا، دلتا و ميو را ميتوان نام برد؛ که از خانوادهي G پروتئينها ميباشند. با فعال شدن اين گيرنده ها توسط اپيات‌هاي مانند مورفين 1- کانالهاي کلسيمي حساس به ولتاژ4 بسته ميشوند 2- با تأثير بر روي کانالهاي پتاسيمي باعث خارج شدن پتاسيم از سلول و هايپرپلاريزه شدن سلول ميشود 3- باعث مهار آنزيم آدنيلات سيکلاز ميشود. درنتيجه اپياتها باعثِ کاهشِ تحريک پذيريِ غشا و کاهش آزاد شدنِ نورترانسميترها ميشوند. در شکل 1-2 ساختار اين گيرنده و مکانيسم عمل آن نشان داده شده است .(Lambert et al., 2005)از طريق اين مکانيسم اپيات هاي مانند مورفين باعث مهار درد مي شوند. رسپتورهاي اپيوئيدي مختلفي در سلولهاي گوناگون توليد ميشوند و در موقع تحريکپذيري باعث ايجاد تاثيرات متفاوتي مي‌شوند.

شکل 1-2- ساختار گيرنده هاي اپيوئيدي و مکانيسم عمل اين گيرنده

مواد مخدر(اپياتها) حداقل از طريق دو مکانيسم باعث توليد پاداش و تقويت آن ميشوند که عبارتند از:
1. فعالسازي ناحيه تگمنتوم شکمي5 (VTA) که نتيجهاش آزاد شدن دوپامين در هستهي آکومبنس6 است.
2. به طور مستقيم به رسپتورهاي هستهي آکومبنس متصل ميشوند که غير وابسته به دوپامين ميباشد.
مواد مخدري که به صورت غير وابسته به دوپامين باعث ايجاد پاداش و تقويت آن ميشوند به طور مستقيم به رسپتورهاي ميو و شايد دلتا هستهي آکومبنس متصل ميشوند. رسپتورهاي ميو و دلتا هم در ناحيه تگمنتوم شکمي و هم در هستهي آکومبنس وجود دارند. و ممکن است که هر دويِ آنها در مسيرِ پاداش نقش داشته باشند. اپيوئيدهاي مشتق شده از پروداينورفين باعث مهار دوپامين از نورونهاي مزوليمبيک ميشوند و در نتيجه با فعالسازي اين گيرنده ممکن است که باعث ايجاد احساس ناخوشي در انسان و حيوانات شوند. (Kopnisky et al., Chapter 96).

1-3: متآمفتامين(شيشه)
مواد مخدري مثل شيشه با تأثير بر روي نورونهاي دوپامينرژيک باعث آزاد شدن دوپامين
مي شوند. اتواکسيداسيون دوپامين باعث توليد DA- quinone مي شود. DA- quinone يک محصول سمي است که موجب تخريب ميتوکندري، التهاب، ROS و يوبي کوتينه کردن پروتئين مي شود .( Miyazakiy et al., 2008) گلوتاتيون و گلوتاتيون S ترانسفراز ممکن است باعث سم زاديي DA- quinone شوند .( Hashimoto et al., 2005)
1-4: علل گرايش به مواد مخدر
تحريکِ آزادسازيِ دوپامين توسط مواد مخدر ممکن است به شکل يک مسير در ايجادِ لذت در مغز نقش داشته باشد. در واقع نشانگر پيامي است که فرد را به سوي مواد مخدر جذب ميکند .(Tang et al., 2009)
1-5: کانونهاي پاداش و لذت در مغز
ارائه پاداش و احساسِ لذت در مغز از طريق تحريک نواحياي از مغز منجمله ناحيهي تگمنتوم شکمي، هسته آکومبنس، هيپوتالاموس، آميگدال، هيپوکامپ و قسمتهايي از کورتکس پيشاني ميسر است. در مورد سيستم پاداش و لذت کانون اصلي از ناحيهي تگمنتوم شکمي آغاز ميشود و به هستهي آکومبنس ختم ميشود.(Hyman et al., 2006)

1-6: ROS و کانالهاي L-Type کلسيمي
ROS توليد شده در طي استرسهاي اکسيداتيو با تاثير بر روي کانالهاي کلسيمي
(L-Type) باعث افزايش کلسيم سيتوپلاسمي ميشوند. اين کانالها غني از اسيدآمينههاي سيستئين مي باشند، ROS ايجاد شده باعث اکسيد کردن اسيدآمينههاي سيستئين و تشکيل پيوندهاي ديسولفيد و تغيير شکل دادن اين کانالها باعث باز شدن کانالهاي کلسيمي و افزايش کلسيم سيتوپلاسمي ميشوند. کلسيم سيتوپلاسمي وارد ميتوکندري ميشود و باعث ايجاد يک پاسخ ايمني و ايجاد ROS بيشتر مي شوند.(Hool et al., 2007)

شکل1-3- تاثير ROS بر روي کانالهاي کلسيمي و باز شدن کانالها

1-7: منشا ROS و آنزيمهاي آنتياکسيدان
در طي استرس‌هاي اکسيداتيو گونههاي فعال اکسيژن توليد مي‌شوند. گونههاي فعال اکسيژن به عنوان يک سم در نظر گرفته شدهاند. بنابراين گونههاي فعال اکسيژن براي موجوداتي که در محيط هوازي زندگي ميکنند مضر هستند. سوپراکسيد آنيون و هيدروکسيل راديکال به شدت ناپايدار و داراي نيمه عمرکوتاه هستند، در حالي که پراکسيدهيدروژن به صورت آزادانه منتشر ميشود و داراي نيمه عمر طولاني است.گونههاي فعالِاکسيژن بهوسيلهي چندين سيستم آنزيمي متفاوت به صورت آندوژنز يا اگزوژنز از محيط توليد ميشوند. پس منشأ آندوژنز شامل ميتوکندري، پراکسيزوم، ليپواکسيژنز، سيتوکروم 450P وسايتوکاينهاي التهابي ميباشد. منشأ اگزوژن شامل اشعهي UV، اشعههاي يونيزهکننده، داروهاي شيميدرماني و سمهاي محيطي ميباشد.(Terada et al., 2005)
براي غيرفعال کردن اين ROS ها، سلولها آنزيمهاي آنتياکسيدان مانند کاتالاز که يکي از مهمترين آنزيمهاي آنتياکسيدان درونزا را ميسازند که باعث تبديل پراکسيدهيدروژن به آب و اکسيژن مي شود .(Ghaly et al., 2012) گلوتاتيون S ترانسفراز خانوادهاي از آنزيمهاي چندکاره هستند که در فاز II متابوليسم باعث سمزدايي ترکيباتِ کارسينوژن، ديگر ترکيباتِ الکتروفيليک و ROS ميشوند .(Pemble et al., 1994)

1-8: گلوتاتيون Sترانسفرازها (GSTs)7
گلوتاتيون S ترانسفراز خانوادهاي از آنزيمهاي سمزدايي در فاز دوم متابوليسم هستند، که مسئول حفاظت از ماکرومولکولهاي سلولي و کاتاليز کردنِ ترکيباتِ کارسينوژنيک ازطريق کنژوگه کردن آنها با گلوتاتيون ميباشد. در شکل 1-1 طريقهي کنژوگه کردن ترکيبات زنوبيوتيک به گلوتاتيون توسط آنزيمهاي گلوتاتيون S ترانسفرازها نشان داده شده استTownsend et al., 2003) ).GSTs در باکتريها، گياهان و جانوران وجود دارند و حدود يک درصد از کل پروتئين‌هاي سلولي در يوکاريوتها و بعضي از پروکاريوتها را تشکيل
ميدهند .(Ren et al., 2009) در انسان بيشترين سطح فعاليت GSTs در کبد است در حالي که کليه، شش و روده سطح فعاليت کمتري نسبت به کبد دارند .(Pacifici et al., 1988) GSTs در بسياري از فرآيندهاي فيزيولوژيکي مانند کاهش آسيب راديکالهاي آزاد، سم زدايي، بيوسنتز و متابوليسم پروستاگلاندينها، استروئيدها، لوکوترينها و تنظيم سيگنال سلولي نقش دارند .(Laborde et al., 2010)
گلوتاتيونS ترانسفراز انساني به سه خانوادهي سيتوزولي8، ميتوکندريايي9 و ميکروزومي10 تقسيم ميشوند. گلوتاتيون S ميکروزومي ساختارهاي مجزا از گلوتاتيون S ترانسفرازهاي سيتوزولي ميباشند ولي داراي عملکرد مشابه در تواناي کنژوگه کردنGSH به ترکيبات الکتروفيليک هستند (McIlwain et al., 2006).

گلوتاتيون S ترانسفراز هاي انساني: GSTs انساني عبارتند از: alpha روي کروموزوم 6p12، mu روي کروموزوم1p13 ، theta روي کروموزوم 22q11، pi روي کروموزوم 11q13، zeta روي کروموزوم14q24، sigma روي کروموزوم 4، kappa روي کروموزوم 7q34 وmgst1 روي کروموزوم 12p12، تعداد زيرواحد و ژن در شکل 1-2 نشان داده شده است .(Strange et al., 2001)

GSTs سيتوزولي: GSTs سيتوزولي داراي زيرواحدهاي 29-24 کيلودالتوني هستند و ميتوانند باعث تشکيل هومودايمر يا هترودايمر شوند فرم فعالِ آنزيم به صورت دايمر ميباشد و هر آنزيم فعال داراي دو سايت است که عبارتند از G-site و H-site. G-site به GSH و H-site به ترکيبات هيدروفوب متصل ميشود. GSTs سيتوزولي را بر اساس همولوژي توالي، نقطهي ايزوالکتريک، انتخاب سوبسترا و کنتيک آنزيمي تقسيم بندي ميکنند .(Van der Aar et al., 1996)
GSTs سيتوزولي شاملِ گلوتاتيون S ترانسفراز Alpha،Mu ،Omega ، Pi، Sigma، Theta و Zeta هستند، در جدول 1-1 گلوتاتيون S ترانسفراز سيتوزولي پستانداران نشان داده شده است .(Laborde., 2010)در جدول 1-2 حالتهاي همودايمر GSTs و سوبستراهاي مشخص شده براي هريک از GSTs هاي سيتوزولي انساني نشان داده شده است. ايزوآنزيمهاي GSTs سيتوزولي در انسان درداخل يک کلاس بيش از 40 درصد، و با کلاس هاي ديگر، کمتر از 25 درصد داراي همانندي هستند .(Terada., 2005)تمرکز عمده بيشتر بر روي دومين حفظ شدهيN ترمينال گلوتاتيون S ترانسفراز سيتوزولي است که داراي اسيدآمينههاي کاتاليتيکي فعال تيروزين، سيستئن يا سرين مي باشد .(McIlwain et al., 2006)

جدول1-1- GSTs سيتوزولي پستانداران
شکل 1-4- آنزيم هاي GST مسئول کاتاليز کردن ترکيبات کارسينوژنيک و سايتوتوکسيک
از طريق کنژوگه کردن آنها با گلوتاتيون ميباشند

شکل 1-5- خانوادهي سوپر ژن گلوتاتيون s ترانسفراز

جدول 1-2- سوبستراهاي مناسب آنزيم گلوتاتيون – s – ترانسفراز انساني

1-9: ژن GSTM1
اين آنزيم به دليل ارتباطش با سرطان مثانه و ديگر سرطانهاي که که با عادت به سيگار کشيدن داراي ارتباط باشند و به دليل نقش آن در سمزدايي بنزوآلفا پيرن11 و ديگر هيدروکربن هاي آروماتيک چند حلقهاي موجود در دود تنباکو مورد توجه قرار گرفته است.(Engel et al., 2002)
ژن هاي کلاس Mu، به صورت يک خوشهي ژني متشکل از ژنهاي GSTM1، GSTM2، GSTM3، GSTM4 و GSTM5 که برروي کروموزوم 1p13.3 واقع شدهاند. ترتيب قرار گرفتن آنها بر روي کروموزوم به صورت GSTM4-GSTM2-GSTM1-GSTM5-GSTM3-3′ 5′- است Pearson et al., 1993) .(Strange et al., 2001, ژن GSTM1 پلي مورف است. چندشکليهاي که از ژن GSTM1 شناسايي شده است: يکي از اين چند شکلي ها به صورت GSTM1 null و ديگر به صورت GSTM1 A و GSTM1 B هستند. GSTM1 null هيچ محصول پروئتيني را کد نميکند. ژنهاي GSTM1Aو GSTM1B کدکنندهي پروتئينهاي GSTM1 A وGSTM1 B هستند، که داراي عملکرد يکسان و تفاوت اين دو فقط در يک اسيدآمينه است . پروتئين GSTM1 A داراي اسيدآمينهي لايزين در موقعيت 172 هست در حالي که پروتئين GSTM1 Bداراي اسيدآمينه ي آسپارژين در همين موقعيت است. محصول اين دو تا ژن باهم ترکيب و باعث توليد آنزيم هاي فعال همو يا هترودايمر ميشود .(Hatagima et al., 2000)
برخي از افرادِ فاقد ژن GSTM1 و برخي داراي GSTM1 ميباشند. ژنوتيپ GSTM1 null هيچ محصول پروتئيني را کد نميکند. فردِ داراي ژنوتيپ (GSTM1- null) از تمام فعاليت هايي که توسط پروتئين GSTM1 صورت ميگيرد مانند سمزداييِ12 مواد سرطان زا، سم زدايي هيدروکربنهاي آروماتيک چندحلقه اي و ديگر متابوليتهاي فعالِ مربوط به اين آنزيم محروم ميباشد. افرادِ داراي ژنوتيپ present GSTM1که کدکنندهي پروتئين GSTM1 است و باعث سمزداي در فاز دوم متابوليسم ميشوند .(Sharma et al., 2012)

1-10: ژن GSTT1
ژنهاي کلاس theta در انسان عبارتند از: GSTT1 و GSTT2. ژن GSTT1 و GSTT2 بر روي کروموزوم 22q11.2 انساني قرار دارند .(Webb et al. 1996) که بهوسيله ي يک قطعهي kb50 از همديگر جدا شدهاند، آنها داراي ساختار مشابه هستند که از 5 اگزون با توالي يکسان intron/exon تشکيل شده اند.(Strange et al., 2001)
ژن GSTT1 پليمورف است. GSTT1 داراي دو تا ژنوتيپ GSTT1 null و GSTT1 present ميباشند .(Shaikh et al., 2010) ژنوتيپ GSTT1 null هيچ محصول پروتئيني را کد نميکند در نتيجه افراداي داراي ژنوتيپ GSTT1 null فاقد فعاليت آنزيمي هستند. افراد داراي GSTT1 present باعث توليد آنزيم فعال ميشود؛ که ميتواند باعث سم زدايي گونههاي فعال اکسيژن و مواد سرطانزا شود .(Tamer et al., 2004)و فراواني الل نول اين ژن در جمعيتهاي مختلف انساني 60-20 درصد است .(Vellingiri et al., 2014)

1-11: کاتالاز13
آنزيم کاتالاز در ابتدا در سال 1818مورد توجه لويس تنارد قرار گرفت وقتيکه آب اکسيژنه را کشف کرد. فرضيهي او اين بود که پراکسيدهيدروژن به وسيلهي يک ماده ناشناخته باعث آزادسازي اکسيژن ميشود .(Calabrese et al., 1989) درسال 1900اسکارلوو براي اولين بار نام کاتالاز را براي اين ماده انتخاب کرد که در بسياري از گياهان و جانوران وجود دارد (Loew et al., 1900) کاتالاز وزن مولکولي در حدود 240000 دالتون دارد، از چهار زيرواحد يکسان تشکيل شده است، هر زيرواحد داراي يک حلقهي پرتوپورفيرين و يک اتم آهن در مرکزش است. آنزيم کاتالاز يکي از آنزيمهاي مهم آنتياکسيدان داخلي ميباشد. سمومي مانند پراکسيد هيدروژن را به آب و اکسيژن تبديل ميکند. کاتالاز در پراکسي زوم وجود دارد و باعث تجزيهي پراکسيد هيدروژن ميشود. در پستانداران بيشترين سطح کاتالاز در کبد، کليه، گلبولهاي قرمز و کمترين سطح کاتالاز، در بافتهاي همبند وجود دارد (Quan et al., 1986).
پراکسيد هيدروژن در غلظتهاي بالا ميتواند براي سلول سمي باشد و موجب بعضي از فرايندهاي فيزيولوژيکي مانند تقسيم سلولي، آپوپتوز و فعال شدن پلاکتها در غلظت کم شود (Labios et al., 2009).
کاتالاز در دو مرحله باعث تجزيهي پراکسيد هيدروژن و تبديل آن به آب و اکسيژن ميشود. که مکانيسم کلي آن به صورت زير مي باشد .(Aksoy et al., 2004)

آهن در مرکز حلقه‌ي هم وجود دارد. پراکسيد هيدروژن وارد سايت فعال آنزيم ميشود و با اسيدآمينههاي Asn147 و His74 برهمکنش، ميدهد. اين برهمکنش، باعث ميشود که اتم هيدروژن بين اتم هاي اکسيژن منتقل شود و ايجاد يک مولکول آب و تشکيل کمپلکس I شود (کمپلکسI حاوي آهن IVميباشد. Fe(IV) O=) در اين حالت هِم14 در حالت راديکال وجود دارد و با پراکسيدهيدروژن دوم وارد واکنش ميشود و موجب ايجاد يک مولکول آب و اکسيژن ميشود همچنين آنزيم کاتالاز، به حالت پايه که حاوي آهن Fe(III) است برميگردد (Reid et al., 1981, Goyal et al., 2010)

ژن کاتالاز: در انسان ژني که باعث کدکردن آنزيم کاتالاز ميشود بر روي کروموزوم شماره13p11 قرار دارد. ژن کاتالاز داراي 13 اگزون و 12 اينترون ميباشد (Quan et al., 1986). يکي از پليمورفيسمهاي شايع در ژن کاتالاز پلي مورفيسم تک نوکلئوتيدي است که به صورت جابجاي C با T که در ناحيهي پروموترِ ژن کاتالاز(-262C>T) رخ ميدهد بر روي اتصال فاکتورهاي پروتئيني و درنتيجه بر روي فعاليت آنزيم کاتالاز تاثير ميگذارد (Forsberg et al.,2001). در شکل1-4 ساختار ژن کاتالاز و جايگاه چندشکلي ژنتيکي مورد بررسي نشان داده شده است (Liu et al., 2010).

شکل 1-6- شکل شماتيک ژن کاتالاز و جايگاه چندشکلي ژنتيکي مورد بررسي
1-12: هدف
در طي استرسهاي اکسيداتيو گونههاي فعالِ اکسيژن (ROS)15تشکيل ميشوند که با تغيير فعاليت کانالهاي کلسيمي موجب افزايش کلسيم سيتوپلاسم ميشوند .(Hool et al.2007) افرادي که ژن هاي فعال GSTM1 و GSTT1 ندارند يا در ناحيه پروموتور ژن کاتالاز داراي آلل T باشند، توانايي سمزدايي اين گونههاي فعال را ندارند، لذا احتمال اينکه کانالهاي کلسيمي در طي استرس اکسيداتيو همواره باز باشد، بيشتر ميباشد و احتمالا اين افراد احساس درد بيشتري دارند. به همين علت رو به مصرف مواد مخدر ميآورند تا تسکيني بر دردهايشان باشد. با توجه به روند رو بهرشد اعتياد به مواد مخدر، بر آن شديم تا در اين مطالعه به بررسي ارتباط بين چندشکليهاي ژنتيکيِ ژن هاي GSTM ، GSTT1و CAT و اعتياد به مواد مخدر بپردازيم.

.

فصل دوم

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

مروري بر تحقيقات انجام شده

ارتباط چندشکلي ژنهاي GSTM1، GSTT1 و CAT با انواع سرطانها، ديابت مزمن و فراواني اين چندشکليها در جمعيتهاي مختلف موضوع مطالعه در بسياري از مقالات بوده است. ولي با وجود اين تحقيقات ارزشمند هنوز تحقيق جامعي در ارتباط بين چندشکلي ژن GSTM1، GSTT1 و CAT خطر اعتياد به هروئين، ترياک و شيره تاکنون صورت نگرفته است؛که اين پژوهش درصدد انجام آن است.
2-1: مطالعات صورتگرفته بر روي چند شکليهاي ژنتيکي GSTM1
– براساس يک مطالعه که توسطTamer و همکارانش در سال 2005 در ترکيه بر روي چندشکلي ژن GSTM1 در افراد سيگاري با سرطان معده بررسي کردهاند، ژنوتيپ نول GSTM1 ارتباط با پيشرفت سرطان معده دارد .(Tamer et al., 2005)
– براساس يک مطالعه که توسط Piacentini و همکارانش در سال 2012 در ايتاليا بر روي چندشکلي ژنتيکي GSTM1 با آسم در بيماران بزرگسال صورت گرفت هيچ ارتباط معناداري بين اين پليمورفيسم و بيماري آسم در افراد بزرگسال مشاهده نشده است .(Piacentini et al., 2012)
– براساس يک مطالعه که توسط Moasser و همکارانش در سال 2012 در شيراز(ايران) که بر روي پلي مورفيسم ژن GSTM1 با ديابت مليتوس نوع 2 صورت گرفت، ارتباط معناداري بين ژنوتيپ نول اين پليمورفيسم با بيماري ديابت مليتوس نوع 2 مشاهده شده است .(Moasser et al., 2012)
– براساس يک مطالعه که توسط Safarinejad و همکارانش در سال 2013 در تهران(ايران) بر روي چندشکلي ژنتيکي GSTM1 و ريسک ابتلا به سرطان مثانه در 166 مرد مبتلا به سرطان مثانه و 322 مرد سالم صورت گرفت، با مقايسه افراد بيمار و سالم در ارتباط با ژنوتيپ GSTM1 هيچ ارتباط معناداري بين اين پليمورفيسم و ريسکِ ابتلا به سرطان مثانه ديده نشده است .(Safarinejad et al., 2013)
– بر اساس يک مطالعه که توسط Sandoval-Carrillo و همکارانش در سال 2014 در مکزيک بر روي چندشکلي ژنتيکي GSTM1 و افزايش ريسک ابتلا پرهکلامپسي بر روي 112 زن مبتلا به پرهکلامپسي و 233 زن سالم صورت گرفت، با مقايسهي افراد سالم و بيمار در ارتباط با ژنوتيپ GSTM1 هيچ ارتباط معناداري بين اين پليمورفيسم و افزايش ريسک ابتلا به پرهکلامپسي وجو نداشت .(Sandoval-Carrillo et al., 2013)
– براساس يک مطالعه که توسط Nakatome و همکارانش در سال 2009 در ژاپن بر روي چند شکلي ژن GSTM1 و مصرفکنندگان متآمفتامين صورت گرفت، اختلاف معناداري بين ژنوتيپ نولِ اين پليمورفيسم و مصرف متآمفتامين در جمعيت زنهاي مصرفکنندهي متآمفتامين مشاهده نمودند .(Nakatome et al., 2009)
2-2: مطالعات صورت گرفته بر روي چند شکليهاي ژنتيکي GSTT1

براساس يک مطالعه که توسط Moasser و همکارانش در سال 2012 در شيراز(ايران) که بر روي پليمورفيسم ژن GSTT1 با ديابت مليتوس نوع 2 صورت گرفت، هيچ ارتباط معناداري بين ژنوتيپ نول اين پليمورفيسم با بيماري ديابت مليتوس نوع 2 مشاهده نشده است .(Moasser et al., 2012)
براساس يک مطالعه که توسط Sivonova و همکارانش در سال 2009 در اسلواکي بر روي پليمورفيسم ژن GSTT1 با سرطان پروستات صورت گرفت، هيچ ارتباط معناداري بين اين پليمورفيسم و خطر ابتلا به سرطان پروستات مشاهده نشده است .(Sivonova et al., 2009)
براساس يک مطالعه که توسط Hashimoto و همکارانش در سال 2008 در ژاپن صورت گرفت، هيچ ارتباط معناداري بين پليمورفيسمهاي ژن آنزيمهاي مرتبط با GSH، شامل GSTT2(rs1622002)، GSTA1(-69C/T)، GSTO1(rs4925)، GPX1(rs1050450)، GCLM( -588C/T) و GCLM (rs2301022) و مصرف متآمفتامين در جمعيت ژاپن نداشت. ولي فراواني ژنوتيپ نول GSTT1 ارتباط معناداري بالاي در بين مصرف کنندگان متآمفتامين نسبت به گروه کنترل داشته، و ممکن است پليمورفيسم ژن GSTT1 يک ريسک فاکتور ژنتيکي در گسترش اعتياد به مصرف متآمفتامين باشد (Hashimoto et al., 2008).
براساس يک مطالعه که توسط Nakatomeو همکارانش در سال 2009 در ژاپن بر روي چندشکلي ژن GSTT1 و مصرفکنندگان متآمفتامين صورت گرفت، ارتباط معناداري را بين اين پليمورفيسم و مصرف متآمفتامين در جمعيت ژاپن مشاهده کردند .(Nakatome et al., 2009)

2-3: مطالعات صورت گرفته بر روي چندشکلي تک نوکلئوتيدي در ناحيه‌يC-262T پروموتور ژن CAT16
– بر اساس يک مطالعه که توسطChistiakov و همکارانش در سال 2006 در روسيه صورت گرفت، ارتباط معناداري بين پليمورفيسم ژن کاتالاز C-262T با بيماري ديابت نوروپاتي وجود داشت (افراد با ژنوتيپTT ميزان فعاليت کاتالاز گلبولهاي قرمز نسبت به افراد با ژنوتيپ CC بيشتر است .(Chistiakov et al., 2006)
-براساس يک مطالعه که توسط Choi و همکارانش در سال 2007 در آمريکا بر روي چندشکلي هاي ژنتيکي در ژنهاي مرتبط با استرسهاي اکسيداتيو و ريسک ابتلا به سرطان پروستات در افرادي که زياد سيگار ميکشند صورت گرفت، هيچ ارتباط معناداري بين پليمورفيسم ژن کاتالاز C-262T و سرطان پروستات ديده نشده است (مردان کمتر از 65 سال با ژنوتيپ TT با افزايش ريسک ابتلا به بيماري همراه است (Choi et al ., 2007).
-براساس يک مطالعه که توسط Franko و همکارانش در سال 2008 در اسلووني بر روي چندشکلي ژنتيکي کاتالاز C-262Tبا آزبستوزيس صورت گرفت، ممکن هست که ژنوتيپTT ارتباط کمي با ريسک ابتلا به آزبستوزيس داشته باشد (Franko et al., 2008).
– براساس يک مطالعه که توسط Galecki و همکارانش در سال2009 در لهستان بر روي چندشکلي ژنتيکي C-262T با اختلال افسردگي صورت گرفت، هيچ ارتباط معناداري بين اين پليمورفيسم و خطر ابتلا به افسردگي ديده نشده است (Galecki et al., 2009).
– براساس يک مطالعه که توسط Ezzikouri و همکارانش در سال 2010 در مراکش بر روي چندشکلي ژنتيکي کاتالاز262- با سرطان کبد در جمعيت صورت گرفت، ارتباط معناداري بين افزايش ژنوتيپTT با سرطان کبد مشاهده شده است (Ezzikouri et al., 2010).
– بر اساس يک مطالعه که توسط Ghaly و همکارانش در سال 2012 در مصر بروي چندشکلي ژنتيکي کاتالاز262- با بيماري لوپوس اريتماتوز سيستميك صورت گرفت، ارتباط معناداري بين اين پلي مورفيسم با بيماري لوپوس ديده نشده است.(بيماران با ژنوتيپ TT و CT کاتالاز با فعاليت کمتري دارند (Ghaly et al., 2012).
– بر اساس يک مطالعه که توسط Babusikova و همکارانش در سال 2013 بر روي چندشکلي ژنتيکي C-262T و آسيب اکسيداتيو با بيماريِ آسم در کودکان اِسلواکي صورت گرفت، ارتباط معناداري بين افزايش ژنوتيپ TT و بيماران مبتلا به آسم ديده شد (Babusikova et al., 2013).
تاکنون مطالعه اي پيرامون چندشکليهاي CAT و احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر صورت نپذيرفته است.

2-4: فرضيه
فرضيهي 1: ژنوتيپ نول (GSTM1- null) احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر را افزايش مي دهد.
فرضيهي 2: ژنوتيپ نول (GSTT1- null) احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر را افزايش ميدهد.
فرضيهي 3: با افزايش تعداد ژنوتيپهاي نول GSTM1 و GSTT1 احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر افزايش مييابد.
فرضيهي 4: ژنوتيپ CT در مقايسه با ژنوتيپ CC احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر را افزايش ميدهد.
فرضيهي 5: ژنوتيپ TT در مقايسه با ژنوتيپ CC احتمال ابتلا به سوء مصرف مواد مخدر را افزايش ميدهد.
فرضيهي 6: با افزايش آلل T احتمال ابتلا به سوء مصرفمواد مخدر افزايش مييابد.

فصل سوم

روش انجام کار

3-1- نمونهگيري
در اين مطالعه مورد – شاهد، در مجموع 1507 نفر شامل 708 معتاد به هروئين، ترياک، شيشه و شيره هستند که از 6 مرکز دولتي و غيردولتي ترک اعتياد نمونه هاي خون آنها گرفته شده است 799 نفر سالم، به عنوان گروه شاهد در نظر گرفته شدند که نمونههاي خون آنها از پايگاه انتقال خون شيراز فريز شده و به آزمايشگاه آورده شدند. اطلاعات مربوط به هر فرد از طريق پرسش نامهاي که توسط خود فرد تکميل مي گردد به دست آمد. رضايت نامه از بيماران و از افراد سالم اخذ شده، و انجام اين مطالعه توسط کميته اخلاق دانشگاه شيراز تأييد شده است.
3-2- مواد و دستگاه ها
دستگاههاي مورد استفاده در اين پژوهش عبارتند از:
1. سمپلر
2. ترازو
3. Vortex
4. ميکروسانتريفيوژ
5. Electrophoresis( که شامل تانک و منبع جريان برق مي باشد)
6. دستگاه PCR17
7. مايکروفر
8. اتوکلاو

9. دستگاه Gel documentation
10. Rotator
11. pH-meter
12. Hot plate
3-3: استخراج DNA
روش استخراج، روش Boiling يا جوشاندن است که DNA را از گلبولهاي سفيد خون محيطي جدا ميکند. ابتدا بايد محلولهاي استخراج را آماده و سپس اتوکلاو کرد و بعد از اتوکلاو در آون قرار داده ميشوند، در طي چند ساعت و سپس از آنها استفاده کرد.
3-4: مواد مورد استفاده براي انجام PCR
1) پرايمرهاي Forward و Reverse ژنهاي GSTM1، GSTT1 و -globine? (ساخت شرکت تکاپوزيسيت)
2) پرايمرهاي Forward و Reverse ژن CAT
3) آب استريل
4) 10x buffer
5) MgCl2


دیدگاهتان را بنویسید