2-11- استخراج ناقل………………………………………………………………………………………………………………………………26
2-11-1- استخراج ناقل با روش ليز قليايي……………………………………………………………………………………………………26
2-11-1-1- روش انجام استخراج ناقل با روش ليز قليايي…………………………………………………………………………………28
2-11-2- استخراج ناقل با استفاده از کيت شرکت بيو بيسيک………………………………………………………………………….30
2-11-2-1- روش انجام استخراج ناقل با استفاده از کيت شرکت بيوبيسيک……………………………………………………….31
2-12- الکتروفورز DNA بر روي ژل آگارز………………………………………………………………………………………………32
2-12-1- مواد لازم جهت الکتروفورز DNA بر روي ژل آگارز……………………………………………………………………..32
2-12-1-1- بافر TAE…………………………………………………………………………………………………………………………..32
2-12-1-2- بافر TBE…………………………………………………………………………………………………………………………..33
2-12-1-3-تهيه ژل آگارز………………………………………………………………………………………………………………………33
2-12-1-4- نشانگر اندازه DNA…………………………………………………………………………………………………………….34
2-12-1-5-رنگ سايبر گرين………………………………………………………………………………………………………………….35
2-12-1-6- بافر بارگذاري………………………………………………………………………………………………………………………36
2-12-2- تعيين اندازه و غلظت DNA توسط الکتروفورز………………………………………………………………………………36
2-12-3- تخمين غلظت DNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر………………………………………………………………….36
2-13- تهيه سلول هاي مستعد از باکتري اشرشياکلي با روش شيميايي………………………………………………………………..37
2-13-1- مواد لازم………………………………………………………………………………………………………………………………..37
2-13-2- تهيه سلول مستعد………………………………………………………………………………………………………………………38
2-14- ترانسفورماسيون با روش شوک گرمايي…………………………………………………………………………………………….38
2-14-1- روش انجام ترانسفورماسيون………………………………………………………………………………………………………..39
2-15- هضم آنزيمي با آنزيم هاي محدود کننده…………………………………………………………………………………………..40
2-15-1- مواد لازم براي هضم آنزيمي با آنزيم هاي محدود کننده……………………………………………………………………40
2-15-1-1- آنزيم (Thermo scientific) XhoI…………………………………………………………………………………..42
2-15-1-2- آنزيم (Thermo Scientific) NcoI…………………………………………………………………………………..42
2-15-1-3 آنزيم BpiI (Thermo Scientific)……………………………………………………………………………………..42
2-16- خالص سازي DNA از ژل…………………………………………………………………………………………………………….42
2-16-1- مواد لازم براي خالص سازي DNA از ژل……………………………………………………………………………………43
2-16-2- روش انجام استخراج DNA از ژل………………………………………………………………………………………………43
2-17- تکنيک الحاق………………………………………………………………………………………………………………………………44
2-17-1-مواد لازم براي تکنيک الحاق……………………………………………………………………………………………………….44
2-17-2- روش انجام تکنيک الحاق…………………………………………………………………………………………………………..45
2-18- واکنش کلني PCR……………………………………………………………………………………………………………………..45
2-18-1- روش انجام واکنش کلني- PCR………………………………………………………………………………………………..45
2-19- تعيين توالي ژن rice-nsLTP2……………………………………………………………………………………………………..47
2-20-مطالعات بيوانفورماتيکي…………………………………………………………………………………………………………………47
2-20-1-نرم افزار ها و سرورهاي مورد استفاده…………………………………………………………………………………………….47
2-20-2-برر سي توالي nsLTP2…………………………………………………………………………………………………………….48
2-20-3-بررسي هيدروفوبيسيته يnsLTP2 برنج ايراني………………………………………………………………………………49
2-20-4-بررسي خاصيت آنتي ژنيسيتي nsLTP2 برنج ايراني ……………………………………………………………………….50
2-20-5-Molecular Docking………………………………………………………………………………………………………….51
فصل سوم:نتايج
3-1-استخراج ناقل هاي pET26b و pUC57 با روش ليز قليايي ………………………………………………………………52
3-2-نتايج هضم آنزيمي ناقل pET26b وقطعه ي nsLTP2 جهش يافته……………………………………………………….53
3-3-نتايج خالص سازي از ژل………………………………………………………………………………………………………………….54
3-4-واکنش الحاق………………………………………………………………………………………………………………………………..55
3-5-ترانسفورماسيون ناقل pET26b نوترکيب ايجاد شده…………………………………………………………………………..56
3-6-غربالگري ناقل هاي pET26b حاوي ژن nsLTP2 جهش يافته…………………………………………………………..57
3-6-1-واکنش کلني-PCR…………………………………………………………………………………………………………………..57
3-6-2-نتايج استخراج ناقل هاي pET26b نوترکيب…………………………………………………………………………………58
3-6-3- نتايج هضم آنزيمي ناقل نوترکيب…………………………………………………………………………………………………59
3-6-4-نتايج تعيين توالي قطعه ي وارد شده به ناقل pET26b………………………………………………………………………60
3-7-نتايج بخش بيوانفورماتيک………………………………………………………………………………………………………………..61
3-7-1- بررسي ساختار اول پروتئين nsLTP2 برنج …………………………………………………………………………………..61
3-8- جهش زايي پروتئين nsLTP2 برنج ايراني و Molecular Docking…………………………………………………67
فصل چهارم:بحث و نتيجه گيري
4-1 -کليات…………………………………………………………………………………………………………………………………………68
4-2- مقايسهnsLTP2 و nsLTP1 ……………………………………………………………………………………………………….69
4-3- سنتز ژن جهش يافته nsLTP2 گياه برنج ايراني ………………………………………………………………………………….70
4-4 -همسانه سازي ژن جهش يافته ي nsltp2 برنج ايراني……………………………………………………………………………..71
4-5- بررسي نوع وحشي و جهش يافته nsLTP2 گياه برنج ايراني…………………………………………………………………..71
4-6- بررسي خاصيت آنتي ژنيسيتي nsLTP2 گياه برنج ايراني………………………………………………………………………72
4-7- نتيجه گيري کلي…………………………………………………………………………………………………………………………….74
4-8- پيشنهادات جهت تحقيقات آينده……………………………………………………………………………………………………….75
فهرست شکل ها
عنوان صفحه
شکل1-1-تصوير شماتيک ناحيه ي کد کننده ي ژنLTP2 گياه برنج ايراني………………………………………………………5
شکل1-2-بررسي توالي nsLTP1 و nsLTP2 در برخي از گياهان……………………………………………………………….5
شکل1-3-الگوي تشکيل چهار نوع پيوند دي سولفيدي در دو نوع LTP موجود در گياه برنج………………………………6
شکل1-4-توالي و ساختار LTP1………………………………………………………………………………………………………………8
شکل 1-5-توالي و ساختار LTP2…………………………………………………………………………………………………………….9
شکل1-6-نماي کلي از وجود ساختار هاي ثانويه ي آلفا هليکس در ساختار LTP1 و LTP2……………………………..9
شکل 1-7-تطابق اسيد آمينه اي آلرژن هاي LTP……………………………………………………………………………………….12
شکل1-8-برهمکنش ترکيبات مختلف از جمله کلسترول وانواع LTP ،………………………………………………………….16
شکل2-1-دياگرام شماتيک نقشه ي ژنتيکي pET26b………………………………………………………………………………..22
شکل 2-2-دياگرام شماتيک نقشه ي ژنتيکي pUC57…………………………………………………………………………………23
شکل2-3-توالي ژني طراحي شده ي nsLTP2 برنج ايراني…………………………………………………………………………..24
شکل2-4-اندازه نمايDNA…………………………………………………………………………………………………………………..35
شکل2-5-نمايي شماتيک از واکنش ترانسفورماسيون…………………………………………………………………………………..40
شکل3-1-نتايج استخراج ناقل با کيت استخراج پلازميد شرکت بيوبيسيک……………………………………………………….53
شکل3-2-نتايج هضم آنزيمي…………………………………………………………………………………………………………………..54
شکل3-3-بررسي کيفيت قطعات استخراج شده از ژل…………………………………………………………………………………..55
شکل 3-4-نتايج تهيه ي سلول هاي مستعد………………………………………………………………………………………………….56
شکل3-5-نتايج ترانسفورماسيون ناقل pET26b…………………………………………………………………………………………57
شکل 3-6-نتيجه ي کلوني- PCR ………………………………………………………………………………………………………..58
شکل 3-7-استخراج ناقل pET26b نوترکيب……………………………………………………………………………………………59
شکل3-8-بررسي هضم آنزيمي ناقل نوترکيب…………………………………………………………………………………………….60
شکل3-9-نتيجه ي توالي يابي جهش هاي F39A و L28A ……………………………………………………………………..61
شکل3-10-بخش هاي غشاء گذر و هيدروفوب پروتئين nsLTP2 با روش TMHMM………………………………….63
شکل3-11-نواحي هيدروفوب توالي پروتئيني nsLTP2 با روش Sliding Widow……………………………………….64
شکل 3-12-. ميانگين ميزان آنتي ژنيسيته ي آمينو اسيد هاي توالي پروتئيني nsLTP2 در حالت طبيعي………….65
شکل3-13- ميانگين ميزان آنتي ژنيسيته ي آمينو اسيد هاي توالي پروتئيني nsLTP2 در توالي جهش يافته………………….65
شکل3-14- ساختار شيميايي LysoPC14 ……………………………………………………………………………………………..67
فهرست جدول ها
عنوان صفحه
جدول1-1- ساختار هاي LTP1 بررسي شده به وسيله ي NMR و کريستالوگرافي اشعه ي X……………………………7
جدول 2-1-تجهيزات و دستگاه هاي مورد استفاده……………………………………………………………………………………….19
جدول2-2- فهرست مواد مورد استفاده……………………………………………………………………………………………………..20
جدول 2-3- ترکيبات محيط کشت LB…………………………………………………………………………………………………….25
جدول2-4- مواد لازم براي ساخت محلول I استخراج ناقل……………………………………………………………………………27
جدول 2-5-مواد لازم براي ساخت محلول II استخراج ناقل…………………………………………………………………………..27
جدول 2-6-مواد لازم براي ساخت محلول III استخراج ناقل……………………………………………………………………….28
جدول 2-7-مواد لازم براي ساخت محلول TE…………………………………………………………………………………………..28
جدول 2-8-محتويات کيت استخراج ناقل بيوبيسيک……………………………………………………………………………………30
جدول 2-9 مواد لازم براي ساخت بافر TAE10X…………………………………………………………………………………….32
جدول2-10- مواد لازم براي ساخت بافر TBE10X…………………………………………………………………………………..33
جدول 2-11-ترکيب بافر بارگذاري 6X……………………………………………………………………………………………………36
جدول 2-12- مواد لازم جهت تهيه سلول مستعد………………………………………………………………………………………….37
جدول 2-13-غلظت آنتي بيوتيک براي انتخاب سويه ي مقاوم……………………………………………………………………….39
جدول 2-14-ترکيبات لازم براي واکنش هضم آنزيمي دوگانه ب براي ناقل pET26b…………………………………….41
جدول2-15-ترکيبات لازم براي واکنش هضم آنزيمي دوگانه براي ناقل pUC57 …………………………………………..41
جدول 2-16-محتويات کيت استخراج DNA از ژل بيونير……………………………………………………………………………43

جدول 2-17-ترکيبات لازم براي واکنش اتصال با استفاده از ناقل pET26b……………………………………………………45
جدول2-18-مواد مورد نياز براي PCR…………………………………………………………………………………………………….46
جدول 2-19-برنامه ي زماني و دمايي واکنش کلني PCR……………………………………………………………………………47
جدول2-20-نرم افزار ها و سرورهاي مورد استفاده……………………………………………………………………………………….48
جدول 2-21-ميزان هيدروفوبيسيته ي هر آمينو اسيد……………………………………………………………………………………..49
جدول2-22-پارامتر هاي تنظيم شده در زمان Docking……………………………………………………………………………..51
جدول3-1- ويژگي هاي فيزيکو شيميايي nsLTP2 برنج ايراني…………………………………………………………………..62
جدول 3-2-موتيف ها و محل قرار گيري آن ها روي توالي nsLTP2 برنج ايراني……………………………………………63
جدول 3-3-نواحي آنتي ژن توالي پروتئيني nsLTP2 برنج ايراني………………………………………………………………..64
جدول 3-4-نواحي آنتي ژنيک موجود در توالي nsLTP2 برنج ايراني که با MHC-II واکنش مي دهد……………66
جدول 3-5-نواحي آنتي ژن توالي پروتئيني nsLTP2 برنج ايراني که اپي توپ هاي سلول B هستند…………………..66
جدول3-6-نتايج حاصل از جهش زايي پروتئين nsLTP2…………………………………………………………………………..67
جدول 4-1-ميزان وقوع هر آمينو اسيد در اپي توپ ها و پروتئين ها ………………………………………………………………..73
فصل اول
مقدمه
تاريخچه ي پروتئين LTP1
ليپيد ها نقش ضروري را در بيولوژي دارند و به عنوان رابط بين اندامك ها،سلول ها و موجودات تعريف مي شوند.اين گروه از ملكول ها منبع غني از انرژي را ارائه داده و مي توانند به عنوان سيگنال هاي ملكولي و هورموني مهم عمل كنند.ليپيد هاي مورد نياز قسمت هاي مختلف سلول هاي يوكاريوتي از جمله غشاي پلاسمايي و غشاي ساير اندامك ها در اندامك هايي همچون شبكه ي آندوپلاسمي و دستگاه گلژي ساخته و سپس به بخش هاي مورد نظر منتقل مي شوند (Dowhen.1997;Jouhet et al .2007; Kent .1995;vance.2004).بدين ترتيب تبادل قابل توجهي از ليپيد ها بين غشاهاي سلولي مختلف وجود دارد كه در يوكاريوت ها اين پديده از طريق مسير هاي وزيكولي و غير وزيكولي رخ مي دهد( Maxfield and Mondal .2006).غشاي اندامك هايي مثل گلي اكسي زوم ها شامل ليپيد هايي مثل فسفاتيديل كولين،فسفاتيديل گليسرول و فسفاتيديل اتانول آمين است،در حالي كه اين اندامك فاقد آنزيم هاي مورد نياز براي ساخت اين فسفاتيد ها مي باشند.بنابراين اين اندامك بايد ليپيد هاي لازم براي ساخت غشاي خود رااز اندامك هاي سازنده ي آن وارد كند(Moreau et al . 1998).از طرف ديگر عموما ليپيد ها داراي حلاليت ضعيفي در سيتوپلاسم سلول مي باشند كه اين خود حضور يك سيستم انتقالي را ضروري مي سازد.گروهي از پروتئين ها تحت عنوان انتقال دهنده ي ليپيد(LTP) اولين بار از برگ هاي اسفناج استخراج شدند و بر اساس فعاليت و عملكردي كه در انتقال فسفوليپيد ها بين غشاها در حالت in vitro داشتند نامگذاري شدند (kader .1996). اين پروتئين ها توانايي انتقال فسفوليپيد ها،گليكوليپيد ها،اسيد هاي چرب و استرول ها بين ليپيد هاي غشايي از ليپوزوم ها يا ميكروزوم ها به ميتوكندري را دارند و در شرايط in vitro انتقال فسفوليپيد ها را از يك غشاي دهنده به يك غشاي گيرنده تسهيل مي كنند( kader (.1996;Yeast and Rose.2008).LTP ها از جمله فراوان ترين پروتئين ها در گياهان هستند و بيش از 4% حجم پروتئين هاي محلول را تشكيل مي دهند( Carvaho and Gomes et al. 2007;Edstam et al. 2011).
با توجه به فعاليت هاي واضح LTP هاي گياهي در حالت in vitro در ابتدا اين طور فرض مي شد كه اين پروتئين ها فقط در تبادل ليپيد ها در درون سلول نقش دارند،اما اين ايده زماني كه نشان داده شد كه LTP ها به عنوان پيش پروتئين هايي داراي سيگنال پپتيد توليد شده Bernhard et al. 1997)) ،كه به طور مستقيم به ماتريكس خارج سلولي ترشح مي شوند رد شد (Meijer et al.1993;Thoma et al.1993).اين پروتئين ها تاكنون از گياهان مختلفي همچون گندم،جو،گيلاس،آرابيدوپسيس،ذرت،لوبيا،سيب،هلو،گوجه،تاج خروس و برنج استخراج شده اند( Cheng Hui – chun et al.2004. LTP.( ها علاوه بر انواع مختلف گياهان (Wang et al.2004) در باكتري ها ،حيوانات و همچنين بافت هاي انساني نيز يافت مي شوند.اگر چه از نظر توالي LTPهاي گياهي و جانوري هيچ تشابهي ندارند اما شباهت زيادي بين LTP هاي گياهي وجود دارد.در انواع مختلف ساختار گياهي از جمله ديواره سلولي برگ،دمبرگ،ساقه،گل و دستجات آوندي LTP وجود دارد( Yeats and Rose . 2008)، اين ملكول ها داراي PI حدود 10-8 مي باشند. LTP ها قادر به انتقال طيف گسترده اي از ليپيد ها از جمله انواع فسفوليپيد ها،گليكوليپيد ها،استروئيد ها و اسيد هاي چرب بين غشاهاي زيستي مي باشند. بدين ترتيب داراي عملكرد غير اختصاصي بوده و آنها را با نام عمومي 2ns – LTP مي شناسند. اين پروتئين هاي قليايي كوچك بر اساس وزن ملكولي خود به دو گروه nsLTP1 با وزن ملكولي 9 كيلو دالتون و nsLTP2 با وزن ملكولي 7 كيلو دالتون تقسيم مي شوند(Karimian et al.2011). اين دو نوع ملكول ويژگي هاي مشتركي از جمله نقطه ايزوالكتريك بالا،وزن ملكولي پايين،هشت باقي مانده بسيار حفاظت شده از سيستئين كه در تشكيل باند هاي دي سولفيد درون ملكولي دخالت مي كنند را به اشتراك گذاشته اند( Arondel and Kader.2000 ).با اين حال علي رغم تشابهات كلي تفاوت هايي در وزن ملكولي،توالي اسيد آمينه اي و فعاليت هاي بيولوژيكي دارند. (Samuel et al. 2002)
پروتئين هاي خانواده ي LTP1 داراي 90 تا 95 اسيد آمينه و پروتئين هاي خانواده ي LTP2 داراي 70 اسيد آمينه در ساختار اوليه خود مي باشند. (Kader et al.1996) همچنين مطالعات كريستالوگرافي نشان داده كه اختلاف در حفره ي هيدروفوب اين دو پروتئين از مهمترين تفاوت هاي آنهاست.اين حفرة آب گريز در LTP1 به شكل يك تونل است كه از محور ملكولي مي گذرد و در LTP2 به صورت يك محفظه ي خالي هرمي است كه حفرة آب گريز در LTP2 داراي اندازة كوچكتر و انعطاف بيشتري نسبت به LTP1 مي باشد.به اين ترتيب LTP2 با داشتن اين ويژگي توانايي اتصال به ملكولهاي سختي همچون استرول ها را دارد (Elmorjani et al .2004). LTP ها از هر دو خانوادة LTP1 و LTP2 در انتهاي آميني خود سيگنال پپتيدي دارند كه در LTP1 33-24 اسيد آمينه و در LTP2 36-24 اسيد آمينه دارد( Garcia – Garrido et al .1998; Kalla et al .1994).مطالعات انجام شده در مورد LTP1 نسبت به LTP2 بيشتر است.در اين مطالعات توالي نوكلئوتيدي و اسيد آمينه اي،روند تخليصي(Liu et al .2002; Padidar et al . 2009;Segura et al . 1993;Zaman et al . 2009)،فعاليت هاي زيستي مختلف از جمله فعاليت هاي انتقالي و اتصاليCheng Chao-sheng et al.2008))،خواص ضد قارچي و ضد ميكروبي (Kirobakaran et al.2008 ;Yeats and Rose.2008 , Zottich et al.2011)و ساير خواص آن مورد بررسي قرار گرفته است.همچنين ويژگي هاي ساختاري اين ملكولها توسط مطالعات بيوانفورماتيك(Lee et al . 1998) و تكنيك هايي از قبيل NMR و CD بررسي شده است. LTP ها داراي وظايف متعددي از جمله انتقال مونومر هاي كوتين،شركت در مكانيسم دفاعي گياهان،شركت در روند تمايز سلولي،گرده افشاني،جوانه زني و جنين زايي مي باشد( Ekland and Edqvist et al .2003;Cheng Hui – Chun et al.2004). اين پروتئين ها در برابر دماي بالا (تا 80 درجه)،تركيبات دناتوره كننده و هضم آنزيمي مقاومند (Bernardi et al.2011)،ثبات قابل توجه در برابر پروتئوليز (Lindorff – Larsen and Winther.2007) و دناتوراسيون حرارتي ذاتا در ارتباط با خاصيت آلرژي زايي اين پروتئين هاست (Breiteneder and Mills.2004)، به همين دليل اين پروتئين ها مي توانند وارد سيستم هورموني بدن انسان شوند و سيستم عصبي را تحريك كرده و به عنوان آلرژي عمل كنند( Bernardi et al. 2011) .
1-2-ساختار ژني LTP ها
الگوهاي بياني كه براي ژن هاي ltp مربوط به گياهان مختلف وجود دارد پيچيده و در بيشتر موارد موقت و بسيار كنترل شده است (Vignols et al.1997 ; Guiderdoni et al. 2002)، LTP ها شامل يك خانواده چند ژني هستند كه متناسب با نياز گياه در اندام هاي مختلف تنظيم مي شوند،به عنوان مثال LTP برنج توسط حداقل سه گروه ژني كد مي شود( Boutrot Freddy et al.2008 ; Garcia – Garrido et al.1998). بيان ژن هاي ltp در تغيير شرايط محيطي مثل خشكسالي،استرس هاي نمكي،سرما و آلودگي به بيماري زاهاي باكتريايي و قارچي صورت مي گيرد( Jung et al. 2003 ; Jang et al . 2004)،بنابراين LTP ها علل سازگاري گياه در مقابل شرايط استرس زاي غير زنده مثل:افزايش غلظت نمك،سرما و تغييرات تابش نور مي باشد، به اين ترتيب كه بيان ژن هاي ltp در زمان القاء اين شرايط استرس زا افزايش مي يابد.نشان داده شده است كه LTP ها در هنگام القاي نور آبي و قرمز يافت مي شوند.همچنين ملكول هايي مانند ساليسيك اسيد 5.اتيلن 6.متيل جاسمونات كه ملكولي پيام رسان است و بيان ژن هاي پاسخ دهنده به عوامل بيماري زا را القا مي كند در مسير پيام رساني مرتبط با بيان ژن ltp1در گير است(Jung et al . 2003; Jung et al. 2006;Garcia – Garrido et al.1998; Sohal et al.1999;Terres – Schumann et al.1992).
اولين رمز گذاري cDNA يLTP گياهي از كتابخانة cDNA ي ساخته شده از دانه هاي ذرت جدا شد Tchang) et al.1988 )و پس از آن ژن هاي متعدد ltp از گونه هاي مختلف گياهي مثل آرابيدوپسيس تالياناArondel et) al.2000 )،گوجه(Terres- Schumann et al.1992 ;Trevino and O Connel et al.1998)، ذرت(Sossountzov et al.1991) ،فلفل(Jung and Hwang.2000; Park et al.2002 )،جو(Molina and Garcia -Olmedo.1993 ;Molina et al . 1996) و برنج(Vignols et al.1994)‌جدا شدند.
در جو بر اساس هومولوژي توالي و محل كروموزوم ها،ژن هاي ltp مي توانند به دو خانواده متشكل از حداقل 7 ژن كه در سه كروموزوم توزيع مي شوند،تقسيم شوند (Kader.1996).همانطور كه قبلا ذكر شد ،LTP ها متعلق به خانواده ي چند ژني هستند( White et al.1994; Vignols et al.1997 ; Arondel et al.2000)بيش از 30 ژن ltp در ژنوم آرابيدوپسيس تاليانا مشخص شده است( Arondel et al.2000).ژن ltp1 و بيشتر انواع ltp ها داراي اينترون هستند ولي ltp2 برنج فاقد اينترون بوده كه اين مسئله با مقايسه ي ORF مربوط به LTP و توالي آمينواسيدي LTP مشخص شده است(شکل1.1) (Vignols et al.1994). ناحيه ي كد كننده ي ژن ltp غني از GC (به ميزان 75 درصد) مي باشد.ايزوفرم هاي مختلف nsLTP ها اعمال متفاوتي دارند، به عنوان مثال از جوانه ي دانه ي كرچك چهار ايزوفرم جدا شده كه در يك بافت ويژه به صورت متفاوت بيان مي شوند( Garcia – Garrido et al.1998).
در ذرت يك مكانيسمي از ويرايش متناوب،ارائة رونويسي هاي مختلف براي انواع LTP را پشتيباني مي كند( Arondel et al.1997)،در تمام انواع LTP ها نواحي حفاظت شده اي وجود دارد(Pii et al.2009 ;Zottich et al.2011)،همچنين تجمع جهش ها سبب ايجاد ژن هاي كاذبي مي شود كه عموما پروتئين هايي فاقد عملكرد مشخص را كد مي كنند.
شکل1.1.تصوير شماتيک ناحيه ي کد کننده ي ژنLTP2 گياه برنج ايراني.
1-3-ساختار پروتئيني LTP
ساختار اوليه LTP1 از 90 تا 95 اسيدآمينه و LTP2 از 70 اسيدآمينه تشكيل شده است (Kadder.1996). LTP ها فاقد اسيدآمينة آروماتيك تريپتوفان هستند (Kadder.1996) و در برخي از گونه ها به ندرت اسيدآمينة فنيل آلانين در ساختار LTP هايافت مي شود،همچنين داراي دو واحد تيروزين حفاظت شده مي باشند كه در LTP1 يك واحد در انتهاي آميني و يك واحد در انتهاي كربوكسي قرار گرفته است ،ولي در nsLTP2 هر دو واحد در نزديكي انتهاي كربوكسي قرار دارد(شکل 1.2) Douliez et al.2000;Liu et al.2002 ; Samuel et al.2002)).
شکل1.2.بررسي توالي nsLTP1 و nsLTP2 در برخي از گياهان.قسمت هايي که با * مشخص شده است نواحي حفاظت شده در تمام توالي هاي فوق است(Samuel et al.2002).
توالي اسيدآمينه اي LTP هشت باقي ماندة سيستئيني در موقعيت هاي بسيار حفاظت شده دارد كه چهار باند دي سولفيد را تشكيل مي دهد (Kadder.1996) ، همچنين يك باقي مانده ي سيستئيني در ناحية سيگنال پپتيد قرار دارد.الگوي تشكيل چهار باند دي سولفيدي در دو نوع LTP با يكديگ متفاوت است.در LTP1 اسيدآمينة سيستئين شمارة 3 با 50،سيستئين 13 با 27،سيستئين 28 با 73،سيستئين 48 با 87 دو به دو با همديگر تشكيل باند دي سولفيدي مي دهند.اما در LTP2 سيستئين 3 با 35،سيستئين 11 با 25،سيستئين 26 با 61 و سيستئين37 با 68 دو به دو باهم تشكيل باند دي سولفيد مي دهند((Samuel et al.2002;Ziu et al.2002.موقعيت هشت سيستئين در الگوي كلي به حالت: C…C…CC…CXC…C…C مي باشد( Yeats and Rose.2008) كه در موقعيت CXC همانطور كه در شكل 301 مشخص شده است در LTP1 اسيدآمينة آسپاراژين و در LTP2 اسيدآمينة فنيل آلانين قرار دارد( Liu et al.2002;Samuel et al.2002)پس از برش هاي آنزيمي كه به منظور تعيين توالي انواع LTP با روش تجزيه اي ادمن انجام گرفت مشخص شد كه هيچ پروتئازي قادر به برش پيوند بين C27 و C28 در LTP1 و يا برش بين C25 و C26 در LTP2 نيست( Liu et al.2002).

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

شکل1.3:الگوي تشکيل چهار پيوند دي سولفيدي در دو نوع LTP موجود در گياه برنج،که به جز در موتيف CXC تشابه زيادي را نشان ميدهند، در موتيف CXCدر LTP1 اسيد آمينه ي آسپاراژين و در LTP2 اسيد آمينه ي فنيل آلانين قرار دارد (Samuel et al .2002).
1-3-1- LTP1
چندين ساختار سه بعدي از خانوادة LTP1 توسط NMR و كريستالوگرافي اشعة X در هر دو حالت آزاد(بدون اتصال به ليگاند) و هم در ارتباط با ليگاند هاي ليپييدي متفاوت ارائه شده است (جدول 101) (Yeats and Rose.2008 )كه ساختاري فشرده و كروي با چهار باند دي سولفيد تثبيت شده را نشان مي دهد Lee et al.1998; Soufleri et) al.1996) . همچنين مشخص شده كه Asn49 در ساختار LTP1در قسمت موتيف CXC(C48 N C50)در سطح ملکول قرار گرفته است(شکل 601)(Samuel et al.2002)به طور کلي ويژگي هاي ساختاري LTPهاي اين خانواده بسيار مشابه است(شکل401)( Yeats and Rose.2008). ساختار دوم LTP1از چهار مارپيچ آلفا(H1 از cyc3تا H2,Ala17از Ala25تاAla37 ،H3از Thr47تا Ala56،H4از Ala63 تا cyc73)تشکيل شده است و دم بلندي در انتهاي کربوکسي وجود دارد که ساختار مشخصي ندارد (Lee et a1. 1998;soufleri et al.1996). از مهم ترين خصوصيات مطرح شده براي LTPها خاصيت اتصال به ملکول هاي مختلف ليپيدي و انتقال آن هاست که اين عمل بوسيله يک حفره هيدرو فوب درون ملکولي انجام ميگردد.اين حفره آب گريز در LTP1به شکل يک تونل است که از محور ملکولي گذشته و با زنجيره هاي جانبي اسيدآمينه هايArg,Ile,Lue,Lys,Pro,Ser,Thr,Tyr,Val,Ala پوشيده شده است(Lee et al.1998)،اين حفره دو ورودي دارد که يکي کوچک و ديگري بزرگ است و شکلي قيف مانند به حفره مي دهند به اين ترتيب همان طور که قبلا اشاره شد اسيد آمينه هاي هيدرو فوب کوچک مثل Ile,Val,Ala,Leu در تشکيل حفره آب گريز شرکت مي کنند .
جدول1.1: ساختار هاي LTP1 بررسي شده به وسيله ي NMR و کريستالوگرافي اشعه ي X(برخي ساختار ها به صورت آزاد،بدون اتصال به ليگاند وبرخي در اتصال با ليگاند هاي مختلف مورد بررسي قرار گرفته اند) (Yeats and Rose.2008).
گروهي از اعضاي خانواده LTP1در برخي از گونه هاي گياهي مثل آرابيدوپسيس و برنج به غير از هشت باقي مانده سيستئين حفاظت شده باقي مانده هاي حفاظت شده ديگري هم دارند (شکل1.4 (B))، براي مثال باقي مانده Tyr16بسيار حفاظت شده است اما جهت گيري زنجيره هاي جانبي آن از حفره اتصال به ليپيد دور است و بررسي جهش هاي نقطه اي (Lullien-pellerin et al.1999) نشان داده است که در اتصال به ليپيد نقش ندارد (Yeats and Rose.2008). از ديگر باقي مانده هاي حفاظت شده در LTP1 گياه برنج که در ابتداي سومين مارپيچ آلفا قرار گرفته است اسيد آمينه هايAsp43,Arg44 مي باشد (شکل1.4 ((B,C) دو اسيد آمينه ي باردار Arg44,Lys36 در ناحيه ورودي بزرگ تر حفره آب گريز قرار دارند و به بر همکنش و تثبيت مولکول هاي ليپيدي کمک مي کنند(Lee et al .1998).
شکل1.4.توالي و ساختار LTP1.A)حفره ي اتصال به ليپيد LTP1 که توسط ميريستيک اسيد اشغال شده است(Cheng et al.2004).B)مدل ساختار دوم LTP1، ،در اين تصوير چهار آلفا هليکس و باند هاي دي سولفيد موجود در ساختار LTP1 مشخص شده است((Pattersen et al.2004.C)بخش هاي حفاظت شده در ساختار LTP1 آرابيدوپسيس تاليانا،برنج و صنوبر،در قسمت بالاي تصوير باند هاي دي سولفيد و در قسمت پايين مارپيچ هاي آلفاي موجود در ساختار LTP1 برنج نشان داده شده است(Bendtsen et al.2004).
1-3-2 LTP2-
مطالعات ساختاري کمتري نسبت به LTP1 بر روي LTP2 صورت گرفته است ساختار دوم LTP2از سه مارپيچ آلفا ( H1از Cyc3تاAla16، H2از Thr22تا Ala31و H3از Gln33تا Ala40)و همچنين يک قسمت شامل دو مارپيچ خم منفرد(ازTyr45تا Tyr48واز Ala59تا Val58) تشکيل شده است و همانند LTP1 دم انتهاي کربوکسي فاقد ساختاري مشخصي است. ريشه هاي Glyوpro حفاظت شده در LTP2در شکل گيري ساختار مارپيچ ها نسبت به همديگر نقش به سزايي دارند به اين ترتيب که باقي مانده هاي پرولين حفاظت شده بين مارپيچ 1و2 ايجاد دور باريکي(turn) ميکنند(Yeats and Rose.2008) که در تثبيت ساختار ماپيچ ها اهميت دارد(شکل1.5). LTP2 نيز همانند LTP1داراي حفره ي آب گريزي با خاصيت انتقال ليپيد است ريشه هاي اسيد آمينه هاي Leu9,Leu30,Leu37,Ile16,Ile66,Phe40,Tyr49,V50 تشکيل دهنده اين حفره آب گريزند(cheng chao-sheng et al.2008;Liu et a1.2002) حفره آب گريز LTP2 نسبت به LTP1 کوچکتر و انعطاف پذير تر است و بدين ترتيب کارايي انتقالي ليپيدي بالاتري دارند و اجازه ي اتصال انواع گسترده تري از ليپيد ها از جمله استرول ها را ميدهد(Samuel et a1. 2002).

شکل1.5.توالي و ساختار LTP2.A) LTP2 گندم در اتصال با a-L-پالميتوئيل فسفاتيديل گليسرول(Pons et al.2003)B)ساختار دومLTP2 گندم،در اين تصوير مارپيچ هاي آلفا و باند هاي دي سولفيد مشخص شده است.
مطالعات جهش زايي نشان داده است که ايجاد جهش در برخي باقي مانده هاي حفاظت شده مثلval49,Phe36,Leu8 در LTP2 گياه برنج منجر به تغييرات قابل توجهي در ساختار LTP2 ، ليپيد متصل شونده و هم چنين ساختار حفره آب گريز مي شود(Yeats and Rose.2008).حجم حفره آب گريز در هر دو خانواده LTP1,LTP2 قابل تغييراست و اين خصوصيت ويژه باعث اتصال غير اختصاصي تر به انواع ملکول هاي چرب نسبت به پروتئين هاي داراي حفره آب گريز ديگر ميشود(Samuel et a1.2002;Han et al.2007).
شکل1.6:نماي کلي از وجود ساختار هاي ثانويه ي آلفا هليکس در ساختار LTP1 و LTP2 (Samuel et al.2002).
1-3-3- بررسي ارتباط ساختاري LTPو انتقال گروه هاي هيدرو فوب
ويژگي حمل ملکول هاي ليپيدي توسط حفره هيدرو فوب پروتئين هاي هر دو خانواده LTP1,LTP2 در ارتباط با گروه هاي مختلف ليپيدي مورد بررسي قرار گرفته است به عنوان مثال ساختار LTP2 گياه برنج (Samuel et al.2002) و LTP2 گياه گندم در اتصال با پالميتوئيل فسفاتيديل گليسرول بررسي شده است(Hoh et a1.2005;pons et al.2003)و همچنين بررسي هاي ساختاري LTP1استخراج شده از Z.maysدر اتصال با اسيد پالميتيک، تماس ملکول ليپيد با حفره هيدروفوب پروتئين را نشان ميدهد(shin et al.1995).معمولا جهت بررسي نحوه اتصال چربي ها به حفره آب گريز از اسيد هاي چرب نشاندار استفاده مي شود(sodano et al.1997).وضعيت قرارگيري آمينو اسيد ها و جهت گيري زنجيره هاي جانبي آن ها نسبت به حفره ي هيدروفوب در اتصال با ملکول هاي ليپيدي اهميت ويژه اي دارد .آمينو اسيد هاي حفاظت شده اي وجود دارند که نحوه ي اتصال زنجيره جانبي آنها با گروه هاي مختلف اسيد هاي چرب تاثير به سزايي در پايداري و استحکام اين اتصال دارد. يکي از اين آمينو اسيد هاي حفاظت شده که در انتهاي کربوکسيل و در ناحيه 79 قرار گرفته است تيروزين است. اين آمينو اسيد طي مشاهدات آزمايشگاهي فلورسانس طبيعي در فرآيند اتصال به ليپيد نقش به سزايي دارد(Lullien-pellerin et a1.1999). برخي از ساختارها نشان ميدهند که اين باقي مانده با سر قطبي گروه هاي ليپيدي پيوند هيدروژني برقرار ميکنند(charvolin et a1 .1999;Tassin-Moindrot et al.2000).اين آمينو اسيد در ساختار سه بعدي پروتئين در قسمت ورودي بزرگ حفره هيدروفوب قرار گرفته و بين هيدروکسيل تيروزين و گروه کربوکسيل سر قطبي ليپيد پيوند هيدروژني برقرار ميشود .به اين ترتيب تيروزين با اسيد هاي چرب تماس برقرار کرده واتصال ملکول هيدروفوب با پپتيد را تسهيل ميکند(Han et a1. 2001)،اما اين مساله هميشگي نيست (chang et al 2001; Han et a1.2001).
ملکول هاي کوچک درون حفره مخفي ميشوند بنابراين نميتوانند در ارتباط با تيروزين قرار گيرند و ملکول هاي بزرگ هم با سر قطبي خود نميتوانند به تيروزين متصل شوند و در نتيجه اتصال محکمي با ليپيد نخواهند داشت. معمولا نقاط اسيدي دور از نقطه اتصال قرار گرفته اند .


پاسخی بگذارید