3-8-1- مواد تشكيل دهنده محلول نمكي:38
3-9- رسم منحني استاندارد آمونياک39
3-10- تهيه ي معرف هاي سنجش فعاليت آنزيم39
3-11- نحوه ي سنجش فعاليت آنزيم 12آزمايش40
3-11-1- تخمير در بستر جامد طي بهينه سازي توليد با روش RSM:41
3-11-2- اثر پارامترهاي مختلف بر توليد آنزيم در بستر جامد41
3-11-3- استخراج آنزيم42
3-11-4- سنجش فعاليت آنزيم42
3-12- روش تهيه فسفات بافر:42
3-13- اندازه گيري فعاليت آسپارژيناز از نظر کمي43
فصل چهارم: نتايج44
4-1- جداسازي ميکروارگانيسم45
4-2- شناسايي گونه هاي مولد آنزيم45
4-2-1- شناسايي مولکولي……………………………………………………………………………………..46
4-3- اندازه گيري فعاليت آسپاراژيناز از نظر کمي48
4-4- ارزيابي اوليه برخي فاکتورهاي موثر بر توليد آنزيم آسپاراژيناز با استفاده از طراحي آزمايش Plackett-Burman48
4-5- طراحي آزمايش و بهينه سازي فرآيند به روش سطح پاسخ50
4-5-1- تخمير در بستر جامد50
4-5-2- بهينه سازي آماري توليد آسپاراژيناز در بستر جامد51
4-5-3- صحت مدل سطح پاسخ54
4-5-4- نمودارهاي سه بعدي توليد آنزيم در بستر جامد55
فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري61
5-1- جمع بندي67
5-2- پيشنهادات67
فهرست منابع68
فهرست جداول
جدول1- 1- سويه هاي باکتريايي مولد ال آسپارژيناز12
جدول1- 2- اکتينومايست هاي مولد ال آسپارژيناز12
جدول3- 1- مواد به کار رفته در پژوهش26
جدول3- 2- مواد مورد استفاده در تهيه يک ليتر از محيط M927
جدول3-3- شرايط مختلف جهت بهينه سازي واکنش PCR……………………………………………………………30
جدول 3-4- ترکيب مواد براي تهيه مخلوط PCR……………………………………………………………………………….31
جدول3- 5- سطوح کد شده بر اساس طراحي آزمايش به روش Plackett-Burman براي تخمير در بستر جامد33
جدول3- 6- مقادير حقيقي بر اساس طراحي آزمايش به روش Plackett-Burman براي تخمير در بستر جامد34
جدول3- 7- سطوح کد شده بر اساس طراحي آزمايش به روش RSM براي تخمير در بستر جامد36
جدول3- 8- مقادير سطوح کد شده بر اساس طراحي آزمايش يه روش RSM براي تخمير در بستر جامد37
جدول3-9- جدول نشان دهنده مقادير کد شده38
جدول4-1- خصوصيات بيوشيميايي مربوط به باسيلوس جداسازي شده46
جدول4- 2- طراحي Plackett-Burman براي هشت متغير کد شده با فعاليت آنزيم آسپاراژيناز49

جدول4- 3- نتايج آناليز واريانس (ANOVA) براي انتخاب منبع کرن و ازتبا روش طراحي Plackett-Burman در بستر جامد50
جدول4- 4- مقادير مشاهده شده آسپاراژيناز توليد شده در بسترذ جامد با استفاده از روش RSM51
جدول4- 5- آناليز واريانس (ANOVA) براي مدل مربع سطح پاسخ در بستر جامد 53

فهرست نمودارها
نمودار3- 1- منحني استاندارد ترسيم شده براي سنجش فعاليت آنزيمي39
نمودار4- 1- طراحي سطح پاسخ تاثير متقابل ميزان منبع کربن و نيتروژن در توليد آنزيم آسپاراژيناز در بستر جامد55
نمودار4- 2- طراحي سطح پاسخ تاثير متقابل ميزان منبع کربن و دما56
نمودار4- 3- طراحي سطح پاسخ تاثير متقابل منبع کربن و زمان انکوباسيون در توليد آنزيم آسپاراژيناز در بستر جامد57
نمودار4- 4- طراحي سطح پاسخ تاثير متقابل منبع نيتروژن و دما در توليد آنزيم آسپاراژيناز در بستر جامد58
نمودار4- 5- طراحي سطح پاسخ تاثير متقابل منبع نيتروژن در و زمان انکوباسيون در توليد آنزيم آسپاراژيناز در بستر جامد59
نمودار4- 6- طراحي سطح پاسخ تاثيردما و زمان انکوباسيون در توليد توليد آنزيم آسپاراژيناز در بستر جامد60
فهرست اشکال
شکل1- 1- تصوير شماتيك مكانيسم عمل آنزيم ال آسپارژيناز، واسطه كوالانسي مورد نظر از طريق حمله مزوفيلي توسط آنزيم شكل مي گيرد.14
شکل1- 2- نماي شماتيك و جزئي تر از مكانيسم احتمالي عمل در ال آسپارژيناز15
شکل 3-1- برنامه دستگاه ترموسايکلر جهت تکثيرتوالي مورد نظر…………………………………………………….31
شکل3- 2- نشان دهنده لوله هاي حاوي محلول نهايي مورد آزمايش يا test group است.41
شکل3- 3- نشان دهنده استخراج آنزيم ال آسپارژيناز با بهره گيري از کاغذ صافي است.43
شکل4- 1- محيط کشت 9 M45
شکل4- 2- باکتري هاي جداشده در محيط کشت 9 M45
شکل4- 3- رنگ آميزي گرم46
شکل4-4- آناليز کيفي استخراج ژنومي باکتري بر روي ژل آگاروز 1%……………………………………………….47
شکل-4-5 نتايج بلاست 13 باکتري توليد کننده آسپارژيناز……………………………………………………………….48
شکل4- 6- انطباق بين مقدار تجربي و مقدار پيش بيني شده در بستر جامد54
چکيده
در اين تحقيق روش تخمير در بستر جامد به منظور توليد آسپارژيناز توسط سويه جداسازي شده از جنس باسيلوس با استفاده از سبوس برنج انجام گرديد.
بررسي اوليه با استفاده از طراحي Plackett-Burman نشان داد که از ميان منابع کربن مورد آزمايش شامل: سبوس برنج، سبوس گندم، ساقه برنج، ساقه گندم ،سبوس برنج بهترين تأثير را در افزايش توليد آنزيم واز ميان منابع نيتروژن مورد آزمايش شامل: آسپاراژين، عصاره مخمر، پپتون ، تريپتون، آسپاراژين بهترين تأثير در افزايش توليد آسپارژيناز را در بستر جامد نشان دادند(05/0>p). در مرحله بعدي بهينه سازي طي بررسي4فاکتور سبوس برنج، آسپارژين، دماي انکوباسيون، زمان انکوباسيون در 5 سطح بر توليد آسپارژينازبا بکار گيري روش RSM مقدار توليد آنزيم U/g24/69 حاصل شد. در بستر جامد ميزان توليد آنزيم در مقايسه با بکارگيري طراحي آزمايش به روش Plackett-Burman و RSM 3 برابر حاصل شد. همچنين تحقيقات براي تعيين ويژگي هاي آنزيم آسپارژيناز توليد شده توسط سويه باکتريايي جداسازي شده انجام پذيرفت. حداکثر ميزان توليد آنزيم تجربي بدست آمده در بستر جامد در ميزان غلظت سبوس برنج5/1 درصد وزني-وزني، ميزان غلظت آسپاراژين 5/0 درصد وزني-وزني، دماي 30 درجه سانتي گراد، و مدت زمان 72 ساعت بود.نتايج حاکي از اهميت توليد آسپارژيناز در بستر جامد با استفاده از سوبستراي ضايعات سبوس برنج به دليل قيمت ارزان و قابليت دسترسي فراوان و پتانسيل بالا در توليد آنزيم است.
کلمات کليدي: بهينه سازي، ضايعات سبوس برنج، تخمير در بستر جامد

فصل اول:
کليات پژوهش
مقدمه:
آنزيم ها مواد پروتئيني هستند که توسط همه موجودات زنده ساخته مي شوند و کاتاليز واکنش هاي شيميايي را در سلول به عهده دارند. آنزيم ال آسپارژيناز هيدروليز آسپارژين را به آسپارتيک اسيد بر عهده دارد و توسط انواع مختلف سلول ها به ويژه ميکروارگانيسم ها توليد مي شود. آنزيم آسپارژيناز کاربردهاي مختلف صنعتي و دارويي متعددي دارد. آسپارژيناز به عنوان ماده افزودني به مواد غذايي افزوده مي شود و جلوي سنتز اکريلاميد که يک ماده کارسينوژن است را مي گيرد. شناسايي آسپارژيناز به عنوان داروي ضد سرطان به سال 1953 ميلادي و هنگامي که دانشمندان در موش و رت مبتلا به لوسمي لنفوبلاستيک حاد سرم خوک را تزريق کردند و مشاهده شد که پيشرفت بيماري کنترل شد ، باز مي گردد . بعدها مشخص شد که اين خود سرم به تنهايي نبود که باعث مهار تومور شده است بلکه آنزيم ال آسپارژيناز در مهار تومور موثر بوده است. بعد از انجام تحقيقات گسترده مشخص شد که آسپارژيناز به دست آمده E.coli و Erwinia بهترين نوع داروي ضد سرطان است. آسپارژيناز هم چنين به عنوان دارو با نام تجاري ال آسپار براي درمان لوسمي حاد لنفوبلاستيک به کار مي رود. بر خلاف ساير داروهاي مورد استفاده در درمان لوسمي حاد لنفوبلاستيک، آسپارژيناز را مي توان به صورت درون عضلاني و داخل وريدي بدون ترس از تحريک بافت به کار برد.در اين پژوهش به بررسي توليد آنزيم ال آسپارژيناز در باکتري هاي جدا شده از خاک و بررسي فعاليت آنزيمي آن ها به روش RSM پرداخته شده است.
1-1- اهداف پژوهش
1- جداسازي باکتري هاي توليد کننده آنزيم ال آسپارژيناز
2- تاثير فاکتورهاي موثر محيطي و اجزاء تشکيل دهنده محيط کشت بر روي توليد آنزيم
3- بدست آوردن شرايط بهينه توليد آنزيم از باکتري ايزوله شده با استفاده از روش Response surface method
1-2- فرضيه هاي پژوهش
1- تغيير فاکتورهاي محيطي و اجزاء تشکيل دهنده محيط کشت درافزايش توليد آنزيم ال آسپارژيناز تاثير دارد.
2- با استفاده از روش Response surface method مي توان به شرايط بهينه توليد آنزيم دست يافت.
1-3- پرسش هاي پژوهش
1-از بين باکتري هاي جداسازي شده کداميک توانايي بيشتري در توليد آنزيم ال آسپارژيناز دارند؟
2-آيا تغيير فاکتورهاي محيطي و اجزاء تشکيل دهنده محيط کشت درافزايش توليد آنزيم ال آسپارژيناز تاثير دارد؟
3-آيا با استفاده از روش Response surface method مي توان به شرايط بهينه توليد آنزيم دست يافت؟
1-4- تعريف اصطلاحات و واژگان تحقيق
1-4-1- آنزيم ها و ساختار آن ها
آنزيم ها موادي پروتئيني هستند كه توسط سلول ها توليد شده و به عنوان كاتاليست جهت سرعت بخشيدن به اين واكنش هاي شيميايي كه در سلول رخ مي دهند، عمل مي كنند. آنزيم ها مي توانند سرعت واكنش هاي سلول را تا 106 تا 1012 افزايش داده و اين امكان را ايجاد كنند كه واكنش ها در دماي عادي سلول انجام بگيرد.
كار يك آنزيم اين است كه ساختار مولكول مورد نظر را تغيير مي دهد كه اين تغيير مي تواند اضافه كردن يك اتم به مولكول، شكافتن يك مولكول به دو مولكول كوچك تر يا به هم پيوند دادن دو يا چند مولكول كوچك براي ايجاد يك مولكول بزرگ تر باشد اما حقيقت اصلي و ثابت اين است كه آنزيم همواره سبب ايجاد تغييري گذرا در ماده مورد نظر مي شود. [1]
آنزيم ها همانند ساير پروتئين ها از آمينو اسيدها تشكيل شده اند اما از لحاظ عملكرد با آن ها متفاوت اند و اين توانايي را دارند كه بدون اين كه ساختار خودشان دچار تغيير بشود در واكنش هاي شيميايي را تسهيل كنند.
همانطور كه اشاره شد آنزيم ها از به هم پيوستن واحدهاي آمينو اسيد توسط پيوند پپتيدي به هم ايجاد شده اند. آنزيم ها را مي توان با نمك ها، حلال ها و ساير واكنشگرها رسوب داد يا دناتوره كرد. وزن مولكولي آنزيم ها از 10000 تا 2000000 متغير است.
بسياري از آنزيم ها براي فعاليت خود نياز به حضور يك ماده به نام كوفاكتور دارند. به كل ساختار فعال آنزيم هولو آنزيم گفته مي شود كه شامل اپوآنزيم( جزء پروتئيني)+ كوفاكتور( كوآنزيم، گروه پروستتيك يا يون فلزي فعال كننده ) است.[2]
1-4-2- مكانيسم عمل آنزيم ها
بر اساس استدلال فيشر بسياري از آنزيم ها به هنگام تشخيص كمپلكس آنزيم-سوبسترا مانند روشي كه يك كليد با قفل جفت مي شود عمل مي كنند. به چنين قفل آنزيمي، جايگاه فعال گفته مي شود. در بيشتر آنزيم ها، جايگاه فعال بر روي سطح آنزيم، شكلي شبيه به يك شكاف يا جيب را به خود مي گيرد . وظيفه جايگاه فعال علاوه بر شناسايي سوبسترا، فراهم آوردن فضايي سه بعدي براي محافظت سوبسترا در برابر حلال و نيز تسهيل كاتاليز واكنش است. [1]
آنزيم ها به منظور تسهيل روند واكنش مكانيسم هاي متعددي را مورد استفاده قرار مي دهند ولي به طور كلي تركيب هاي مختلفي از چهار نوع مكانيسم عمومي، سبب ايجاد توانايي كاتاليزوري در آنزيم و افزايش سرعت واكنش است:
الف) كاتاليز واكنش از راه مجاورت:
مولكول ها براي اين كه بتوانند با هم واكنش بدهند بايد تا حد تشكيل پيوند به هم نزديك گردند و هر چه غلظت مولكول ها بيشتر باشد احتمال برخورد و بنابراين سرعت واكنش افزايش مي يابد. هنگام برقراري اتصال بين آنزيم و سوبسترا در جايگاه فعال، ناحيه اي موضعي با غلظت بالاي سوبسترا به وجود مي آيد. اين محيط باعث فراهم شدن جهت مطلوب قرارگيري براي مولكول هاي سوبسترا و افزايش سرعت واكنش مي شود.[3]
ب)كاتاليز اسيد-باز
گروه هاي فعال با قابليت يونيزه شدن در زنجيره جانبي اسيدهاي آمينه و يا گروه هاي پروستتيك، از راه خاصيت اسيدي يا بازي در فرايند كاتاليز شركت مي كنند. اين نوع كاتاليز مي تواند به صورت عمومي يا اختصاصي انجام شود. در نوع اختصاصي سرعت واكنش به تغييرات غلظت پروتون ها حساسيت دارد و به غلظت ساير اسيدها يا بازها ارتباطي ندارد. سرعت واكنش هاي عمومي به تغييرات همه اسيدها يا بازهاي موجود در محيط بستگي دارند. [4]
ج)كاتاليز كششي
در واكنش هاي ليتيك آنزيم هاي مربوطه به نحوي به سوبستراي خود وصل مي شوند و با ايجاد نوعي حالت گذار،شكل فضايي پيوندي كه بايد شكسته بشود را تاحدودي نامطلوب مي سازند. به اين صورت كشش ايجاد شده پيوند مذكور را سست كرده و آن را براي شكستن مستعد مي سازد. [5]
د)كاتاليز كوالانسي
در اين نوع فرايند ميان آنزيم و يك يا چند سوبسترا پيوند كوالانسي به وجود مي آيد و آنزيمي كه به اين صورت تغيير پيدا كرده وارد واكنش مي شود. اين نوع كاتاليز واكنش را از مسيري با انرژي فعال سازي كمتر و در نتيجه سرعت بيشتر هدايت مي كند و بعد از انجام واكنش آنزيم دوباره به حالت اول خود باز مي گردد.[4]
1-4-3- عوامل موثر بر فعاليت آنزيم ها
داشتن اطلاعات پايه در رابطه با تئوري كينتيك در تحليل و شناسايي آنزيم ها هم براي درك مكانيسم پايه اي آنزيمي و هم براي انتخاب روش مناسب در سنجش فعاليت آنزيم موثر و مفيد است. شرايطي كه براي ارزيابي فعاليت يك آنزيم در نظر گرفته مي شود با شرايط مورد نظر درمورد ارزيابي غلظت سوبسترا مانند هم نيستند. عوامل متعددي وجود دارند كه واكنش آنزيمي را تحت تاثير قرار مي دهند مانند، دما، pH ، غلظت آنزيم، غلظت سوبسترا و حضور بازدارنده ها و فعال كننده ها. [3]
الف)تاثير دما بر واكنش هاي آنزيمي
مانند ساير واكنش هاي شيميايي، نسبت واكنش كاتاليز شده توسط آنزيم با افزايش دما افزايش پيدا مي كند. افزايش دما تا 10 درجه سانتي گراد باعث افزايش فعاليت آنزيم به ميزان 50 تا 100% مي شود. در برخي از واكنش هاي آنزيمي افزايش دما تاثير معكوس روي واكنش دارد. البته دماي بالاي 40 درجه نيز براي عملكرد اكثر آنزيم ها مناسب نيست و باعث دناتوره شدن يا غيرفعال شدن آن ها مي شود. اكثر آنزيم ها در شرايط آزمايشگاهي در دماي 5 درجه سانتي گراد نگه داري مي شوند و يخ زدگي باعث از دست رفتن فعاليت در برخي از آنزيم ها مي شود. [4]
ب) تاثير pH
آنزيم ها تحت تاثير تغييرات pH قرار مي گيرند. مناسب ترين ميزان pH كه در آن آنزيم بيشترين فعاليت را دارد pH اپتيمم يا بهينه نام دارد. ميزان خيلي بالا يا پايين pH منجر به از دست رفتن فعاليت آنزيمي مي شود. هم چنين pH يكي از عوامل موثر در ثبات و پايداري آنزيم به شمار مي آيد. آنزيم ها داراي محدوده اي از pH بهينه براي ثبات خود هستند.
ج)غلظت آنزيم
براي بررسي تاثير غلظت بالاي آنزيم در سرعت واكنش، سوبسترا بايد در مقدار زياد حضور داشته باشد به عنوان مثال واكنش بايد مستقل از غلظت سوبسترا باشد. به اين ترتيب هر تغييري در ميزان محصول توليد شده با ميزان حضور آنزيم مرتبط خواهد بود. به اين نوع واكنش ها “zero order” گفته مي شود چون سرعت آن ها مستقل از غلظت سوبسترا و برابر با ثابت K است. [5]
د) غلظت سوبسترا
از لحاظ تجربي نشان داده شده است كه اگر مقدار آنزيم ثابت نگه داشته شود غلظت سوبسترا تدريجا افزايش مي يابد و شدت واكنش تا رسيدن به يك مقدار بيشينه افزايش مي يابد. بعد از اين مرحله با افزايش ميزان سوبسترا شدت واكنش افزايش پيدا نخواهد كرد.
د)تاثير بازدارنده ها
بازدارنده هاي آنزيمي موادي هستند كه عملكرد كاتالتيك آنزيم را تحت تاثير قرار مي دهند و در نهايت باعث كاهش سرعت يا توقف واكنش مي شوند. سه نوع بازدارنده آنزيمي متداول وجود دارد:‌ بازدارنده رقابتي، غيررقابتي و بازدارنده سوبسترا. [6]
1-4-4- انواع آنزيم
آنزيم ها معمولا بر اساس تركيباتي كه روي آن ها اثر مي كنند نام گذاري مي شوند.برخي از مهم ترين آن ها مانند ليپاز كه روي چربي ها اثر مي كند و باعث شكسته شدن آن ها به اسيد چرب و گليسرول مي شود، پروتئازها كه پروتئين ها را به زنجيره هاي پلي پپتيدي و در نهايت ساختارهاي پپتيدي كوچك و آمينو اسيدها مي شكند، آميلاز كه نشاسته را به قندهاي ساده تر مانند آميلوز مي شكند يا سلولاز كه سلولز را به واحدهاي گلوكز تبديل مي كند.[7]
نوع ديگري از طبقه بندي آنزيم ها بر اساس واكنش هايي است كه كاتاليز مي كنند:
1.اضافه كردن يا حذف آب
الف)هيدرولازها مانند استراز ها، كربوهيدرازها، نوكلئازها، دآمينازها، آميدازها و پروتئاز ها
ب)هيدرازها مانند فوماراز، انولاز، آكونيتاز و كربنيك انهيدراز
2)انتقال الكترون
الف) اكسيدازها
ب) دهيدروژنازها
3) انتقال گروه
الف)ترانس گليكوزيداز
ب)ترانس فسفوريلاز و فسفوموتازها
ج) ترانس آميناز
د) ترانس متيلاز
ه) ترانس استيلاز
4) ايجاد يا شكستن پيوندهاي كربن-كربن
الف) دسمولازها
5) تغيير شكل هندسي يا ساختار مولكول
الف) ايزومرازها
6) پيوستن دو مولكول به هم از طريق هيدروليز ATP يا ساير مولكول هاي تري فسفات
الف) ليگاز ها[5]
1-4-5- آنزيم هاي ميكروبي و انواع آن ها
آنزيم ها در همه سلول هاي زنده و بنابراين در همه ميكروارگانيسم ها حضور دارند. هر ميكروارگانيسم تعداد زيادي آنزيم هيدروليز كننده، اكسيد يا احيا كننده و متابوليك را براي خود در طبيعت توليد مي كند. اما ميزان مطلق و نسبي هر يك از اين آنزيم هاي توليد شده بين گونه هاي مختلف و حتي بين سوش هاي مختلف يك گونه متفاوت است. بنابراين طبيعي است كه سويه اي را براي توليد آنزيم در مقياس صنعتي و تجاري انتخاب كنيم كه ميزان بيشتري از آنزيم مورد نظر ما را توليد مي كند. آنزيم هاي تجاري و صنعتي بيشتر از كپك ها، باكتري ها و مخمرها توليد مي شوند. [8]
آنزيم هاي ميكروارگانيسم ها نسبت به آنزيم هاي گياهي و جانوري در استفاده صنعتي و تجاري برتري دارند زيرا، دسترسي به آنها آسان تر است،‌ افزايش بازده توليد در فرايند ميكروبي ساده تر از فرايند هاي گياهي و جانوري است، از لحاظ اقتصادي توليدشان مقرون به صرفه است، امكان دستكاري هاي ژنتيكي بر روي آن ها نسبت به آنزيم هاي گياهي و جانوري بيشتر است،‌ به علاوه تنوع فعاليت كاتالتيك آن ها بيشتر است. در محدوده وسيعي از pH فعال هستند، در عين حال با استفاده از فناوري DNAنوتركيب مي توان آنزيم هاي با منشا جانوري را با بهره گيري از ميكروارگانيسم ها توليد كرد. آنزيم هاي ميکروبي به دليل داشتن چنين ويژگي هايي توجه محققين را به سوي خود جلب کرده اند.[7]
تا ده سال پيش آنزيم هاي صنعتي باكتريايي و قارچي با روش كشت سطحي به دست مي آمدند كه هم اكنون روش هاي كشت Submerged به صورت گسترده مورد استفاده قرار مي گيرند.
اما زماني كه استفاده از آنزيم هاي ميكروبي در مقاصد درماني مد نظر است بعضي مسائل قابليت استفاده آن ها را پايين مي آورد. يكي از مهم ترين اين مشكلات اندازه مولكولي بزرگ بيوكاتاليست هاست كه از توزيع آن ها در سلول سوماتيك جلوگيري مي كند. مشكل ديگر برانگيخته شدن پاسخ ايمني سلول ميزبان بعد از تزريق و ورود پروتئين بيگانه است. البته دانش مدرن امروز با با تغييرات كوالانسي مي تواند آنزيم را با يك ماده غير پروتئيني ديگر احاطه كند و بر اين مشكل غلبه نمايد.
برخي از آنزيم هاي مهم ميكروبي كه در مقاصد درماني مورد استفاده قرار مي گيرند به شرح زير هستند:
ال-آسپارژيناز: خاصيت ضد توموري، ال گلوتاميناز: خاصيت ضد توموري، سوپراكسيد ديسموتاز: آنتي اكسيدان وضد التهاب، سراتيو پپتيداز: ضد التهاب، پني سيلين آسيلاز: سنتز صنعتي آنتي بيوتيك، كلاژناز: درمان ضايعات پوستي، ليپاز: تجزيه زيستي ليپيدها، استرپتوكيناز: ضد انعقاد، يوروكيناز: ضد انعقاد، لاكاز: سم زدا، ال آرژيناز: ضد تومور، ريبونوكلئاز: ضد ويروس.[9]
1-4-6- معرفي آنزيم ال-آسپارژيناز
آنزيم ال آسپارژيناز، در صنعت رو به رشد استفاده از آنزيم هاي ميكروبي اخيرا توانسته است از جايگاه مناسبي برخوردار بشود كه اين به دليل پتانسيل آنزيم مذكور براي استفاده در درمان لنفوبلاستوماهاي بدخيم به ويژه لوسمي لنفوبلاستيك حاد و لنفوساركوما و نيز استفاده در صنايع غذايي براي جلوگيري از تشكيل اكريلاميدها در مواد غذايي سرخ شده در حرارت بالا است. اين آنزيم گزينه اي براي درمان لنفوماي غير هوچكين، كارسينوماي پانكراتيك ، لنفوساركوماي گاوي نيز هست همين خاصيت ضد سرطاني باعث شده تا توجه محققين بيش از پيش به سمت آن معطوف گردد.
عملکرد ضد سرطاني اين آنزيم مربوط به احيا ال-آسپارژين است و دليل اين امر در ناتواني سلول هاي توموري در سنتز آسپارژين است که به اين ترتيب به صورت انتخابي فقط سلول هاي توموري کشته مي شوند. [10]
اين آنزيم اولين بار در سال 1953 و با كشف اين مسئله كه عامل ضد لنفوما در سرم خوك هاي گينه اي ال آسپارژيناز بوده است نظر دانشمندان را به خود جلب كرد.[11]
آنزيم ال آسپارژيناز واكنش تبديل ال آسپارژين را به ال آسپارتيك اسيد و آمونياك كاتاليز مي كند. سميت انتخابي روي سلول هاي لوسميك بدون تاثير گذاشتن روي سلول هاي سالم به دليل كاهش موثر سطح ال آسپارژين در پلاسما در بدن ايجاد مي شود كه منجر به جلوگيري از سنتز پروتئين و در نهايت توقف سنتز DNAو RNA مي شود كه القا آپوپتوز در سلول مبتلا به لوسمي را در پي خواهد داشت. سلول هاي توموري نيازمند به دست آوردن آمينو اسيد ال آسپارژين از مايعات بدن نياز دارند. از آن جايي كه برخي از سلول هاي مبتلا به لوسمي به طور كامل با سلول هاي طبيعي متفاوت هستند، قادر به ساختن آسپارژين سنتتاز نيستند و به طور كامل به ال آسپارژين اگزوژن وابسته هستند[12] ال آسپارژيناز جايگزين مناسبي براي روش هاي متداول و استاندارد شيمي درماني در اين زمينه به حساب مي آيد. به كارگيري چنين پروتئين هاي آنزيمي براي مدت طولاني، باعث توليد آنتي بادي مشابه در بافت ها در نتيجه شوك آنافيلاكتيك يا خنثي سازي تاثير دارو مي شود، بنابراين استفاده از ال آسپارژيناز جديد سرولوژيك با تاثيرات درماني مشابه به شدت مطلوب است.[13]
در بيشتر ميکروارگانيسم ها ال آسپارژيناز به صورت يک محصول داخل سلولي هم در فضاي پريپلاسمي و هم در سيتوپلاسم تجمع مي يابد.
آنزيم ال آسپارژيناز علاوه بر خاصيت ضد سرطاني تاثيرات شديد ايمونو ساپرسيو در شرايط in vivo و in vitro دارد.[14]
1-4-7- منابع توليد آنزيم ال آسپارژيناز
آنزيم ال آسپارژيناز در بسياري از بافت هاي جانوري، گياهي و باكتري ها و در سرم گروه هاي خاصي از جوندگان يافت مي شود ولي در انسان وجود ندارد. باكتري هاي متعددي قادر به توليد ال آسپارژيناز هستند که به مهم ترين آن ها در جدول زير اشاره شده است.
جدول1- 1- سويه هاي باکتريايي مولد ال آسپارژيناز
Serratia marcescensEntrobacter aerogenesE.coliErwinia carotovora Pseudomonas aeroginosaPseudomonas stutzeriBasilus subtilis
جدول1- 2- اکتينومايست هاي مولد ال آسپارژيناز
Streptomyces griseusStreptomyces albidoflavus,S.karnatakensisS.albidoflavusNocardia spدر ميان مخمر ها ساكاروميسس سرويزيه قادر به توليد آنزيم ال آسپارژيناز مي باشد علاوه بر اين گونه هاي قارچي مانند Aspergillus tereus و Aspergillus tamariو برخي ديگر از قارچ هاي رشته اي نيز مولد اين آنزيم هستند.[15]
باكتري E.coli دو نوع ال آسپارژيناز توليد مي كند: ال آسپارژيناز I كه در سيتوپلاسم يافت مي شود و ال آسپارژيناز II كه در فضاي پريپلاسمي وجود دارد. اين دو نوع آنزيم از لحاظ شرايطي كه در آن ساخته مي شوند با هم متفاوت هستند. ال آسپارژيناز I به صورت پيوسته سنتز مي شود و ال آسپارژيناز II تحت شرايط بي هوازي و محيط هاي با تراكم بالاي آمينو اسيد و حضور مقادير ناچيز يا به طور كلي غياب قندها ساخته مي شود. بنابراين وقتي باكتري به صورت هوازي در محيط حاوي گلوكز رشد مي كند فقط آنزيم سيتوپلاسمي را توليد مي كند. اين آنزيم به E.coli اجازه مي دهد تا ال آسپارژيناز را به عنوان منبع خالص نيتروژن استفاده كند.[16]
آنزيم ال آسپارژيناز II در E.coli يا EcAII تمايل شديدي به پيوند با سوبسترا دارد و Km آن برابر با
5-10* 15/1است. در حالي كه EcAI تمايل كمتري به سوبسترا دارد و بنابراين براي مقاصد درماني در زمينه سرطان مناسب نيست.[17]
1-4-8- مكانيسم عمل و ساختار آنزيم ال آسپارژيناز
ساختار كريستالي آنزيم ال آسپارژيناز در E.coli و ، Erwinia carotovora مورد شناسايي و بررسي قرار گرفته است. هر دوي اين آنزيم ها به صورت هموتترامر فعال هستند؛ هر دوي اين آنزيم ها داراي چهار زير واحد مشخص 326 واحدي هستند. در هر يك از چهار جايگاه فعال يك مولكول محصول واكنش ال آسپارژين متصل شده است كه تعيين كننده تقابل ميان آنزيم و سوبسترا است.
تترامر آنزيمي از يك جفت دايمر و يك رابط دايمري بزرگ تشكيل شده است. دايمرهاي اين تترامر را با عنوان دايمرهاي نزديك به هم توصيف كرد. هر كدام از اين دايمرهاي نزديك به هم داراي دو جايگاه فعال هستند و هر جايگاه فعال داراي بخشي از بقاياي هر دو مونومر در دايمرهاي نزديك به هم است. در E.coli ساختار كريستالي حاوي چهار مولكول ال آسپارتات است، كه هر يك به يك جايگاه فعال متصل هستند.[18]
گرچه دايمرهاي نزديك به هم براي تشكيل جايگاه فعال ضروري هستند، اما اين واكنش ها اكثرا در درون يك زير واحد شكل مي گيرند و دو بنيان ترئونين(ترئونين 12 و ترئونين89) در آن دخالت دارند، كه مقابل هر دو طرف زنجيره جانبي مولكول ليگاند قرار دارند. از آن جايي كه هر دو بنيان ترئونين براي فعاليت ضروري هستند براي مدت هاي طولاني اين سئوال مطرح بود كه كدام يك از آن ها OHنوكلئوفيل را براي حمله به اتم كربن پيوند آميدي به كار مي برندكه البته به نظر مي رسد ترئونين 12 اين نقش را بر عهده داشته باشد.[19،17]
مكانيسم عمل آنزيم ال آسپارژيناز دقيقا مشخص نشده است اما هيدروليز طي دو مرحله و از طريق تشكيل واسطه بتا-آسيل آنزيم پيشرفت مي كند. شكل زير نماي شماتيكي از مكانيسم عمل احتمالي آنزيم را به نمايش مي گذارد:
شکل1- 1- تصوير شماتيك مكانيسم عمل آنزيم ال آسپارژيناز، واسطه كوالانسي مورد نظر از طريق حمله مزوفيلي توسط آنزيم شكل مي گيرد. [20]
به طور كلي مكانيسم عملكرد در ال آسپارژيناز با سرين پروتئازهاي كلاسيك قابل مقايسه است كه فعاليت در آن ها به حضور يك سري از بنيان هاي اسيد آمينه به صورت معمول Ser-His-Asp كه با عنوان مثلث كاتالتيك از آن ياد مي شود بستگي دارد.[21]
اين مجموعه داراي يك بنيان نوكلئوفيل (Ser) يك باز عمومي (His) و يك بنيان اسيدي (Asp) است كه همگي توسط يك زنجيره از پيوندهاي هيدروژني به هم متصل شده اند. واكنش در دو مرحله پيشرفت مي كند. مرحله اول بخش نوكلئوفيل آنزيم از طريق يك پيوند O-H… قوي به يك بنيان بازي جايگزين متصل شده و به يك اتم كربن از بخش آميدي سوبسترا حمله مي كند كه به يك حالت گذار از تتراهدرال به يك واسطه آسيل منجر مي شود. بار منفي روي اتم اكسيژن گروه آميد در حالت گذار با يك دهنده پروتون مجاور تثبيت مي شود. مجموعه اين دهنده ها به عنوان مجراي اكس آنيون شناخته مي شوند. مرحله دوم نيز مشابه مرحله اول است اما در اين جا حمله به اتم كربن استري با يك مولكول آب فعال شده نوكلئوفيل صورت مي گيرد. [22]
شکل1- 2- نماي شماتيك و جزئي تر از مكانيسم احتمالي عمل در ال آسپارژيناز [18]
1-4-9- خاك و ميكروفلور آن
خاك يك تشكيلات پيچيده است كه اكوسيستم خاك را شكل مي دهد.
تركيب كلي خاك شامل مواد معدني،موجودات زنده، هوا و مواد محلول است. خاك در تشكيل بيومس اوليه نقش دارد و گياهان را در خود جاي داده است و آب و مواد معدني لازم را در اختيار آن ها مي گذارد. فرايند تجزيه مواد آلي و تجمع و تشكيل هوموس در خاك رخ مي دهد.
خاك بر اساس تركيب شيميايي و ويژگي هاي فيزيكي اش زيستگاه مناسبي براي ميكروارگانيسم ها و ساير موجودات زنده تشكيل مي دهد.
موجودات زنده خاك را بر اساس اندازه به سه گروه مي توان تقسيم كرد كه تركيب آن ها بسته به نوع محيط اطرافشان متفاوت است:
ميكروبيوتا: موجودات در اصطلاح ذره بيني كه با چشم غير مسلح قابل رويت نيستند مانند، ويروس ها، باكتري ها، قارچ هاي ميكروسكوپي، پروتوزواها و جلبك ها
مزوبيوتا: 0.2-2 mm)) شامل نماتودها، مايت ها، ميراپدها، حشرات بدون بال، حلزون ها و برخي گياهان ريز
ماكروبيوتا: (>2 mm) كرم هاي خاكي، حشرات بزرگ تر، جوندگاني مانند موش و ريشه گياهان بزرگ .[23]
به طور كلي ميكرو بيوتا يا همان ميكروفلور خاك نقش مهمي را برعهده دارد . يكي از عمده ترين فعاليت هاي ميكروفلور خاك مشاركت در تجزيه و تغييرات زيستي مواد آلي است. ميكروارگانيسم ها مي توانند با هم زيستي با گياهان يا جلبك ها تثبيت نيتروژن انجام داده و همينطور باعث بهبود بافت خاك و نيز اكسيژن رساني به آن بشوند.هم چنين متابوليت هاي توليد شده توسط اين ميكروارگانيسم ها از اهميت بسزايي در پزشكي، داروسازي، صنايع غذايي و … برخوردار است.[23]
در اين پژوهش به جداسازي باكتري هاي مولد ال آسپارژيناز از خاك و نيز سنجش فعاليت آنزيمي آن به روش RSM پرداخته شده است.
1-4-10- تخمير در بستر جامد
از چنين هزارسال پيش تا کنون در آسيا از تخمير بر روي بست جامد بر روي توليد غذا هاي تخميري متنوعي استفاده شده است ولي اين روش به ندرت در اروپا و آمريکاي شمالي به کار مي رود. اين روش از طريق رشد ميکروارگانيسم بر روي مواد جامد که معمولا ترکيبات آلي و فاقد آب آزاد مي باشد صورت مي گيرد.بستر هاي مورد استفاده اغلب غلات ،سبوس،بقولات و مواد سلولوزي مثل کاه و خرده چوب و … مي باشد. فرايندهاي سنتي عمدتا براي توليد غذاهاي تخميري مثل تمپه و سوفوي شرقي ،پنيرها،قارچ هاي خوراکي ،کمپوست و موادسيلويي به کار مي روند.بعلاوه امروزه آنزيم ها ،اسيد هاي آلي از طريق تخمير در بستر جامد توليد مي شوند.[24]
فرايند هاي تخمير در بستر جامد فاقد مکانيسم هاي کنترل پيشرفته اي هستنذ که در تخمير غوطه ور وجود دارد مي باشند.اغلب اين تخميرها به دليل فقدان آگاهي از کنتيک رشد ميکروبي تحت چنين شرايطي استفاده نمي شوند.کنترل محيط درون بيورآکتوربخصوص حفظ همزمان درجه حرارت و رطوبت نيز دشوار است.البته در بعضي موارد تخميردر بستر جامد مناسب ترين روش براي توليد فرآورده هاي خاص مي باشد.به عنوان مثال برخي قارچ ها درتخميرهاي غوطه ور تشگيل اسپور نمي دهندولي در تخمير بر روي بستر جامد اسپور تشکيل مي شود.
اين روش به طور موفقيت آميزدر توليد اسپورهايContiothyrium minitans براي کنترل بيولوژيکي قارچ بيماري زاي گياهي Slcerotinia sclerotiorum به کار مي رود.
تخمير در بستر جامد فرايندي چند مرحله اي مي باشد که شامل :
1-پيش تيمار بستر
2-هيدروليز بستر هاي پلي مري مثل پلي ساکاريد ها و پروتـين ها
3-مصرف فرآورده هاي هيدروليز شده
4-جدا سازي و تصفيه فرآورده هاي نهايي
ميکروارگانيسم هاي به کار رفته در تخميرهاي بستر جامدميکروارگانيسم هايي هستند که فعاليت آبي نسبتأ پايين 7/0aw= را تحمل مي کنند[24]
1-4-10-1- سوبستراهاي مورد استفاده براي توليد آنزيم در بستر جامد
در سيستم تخمير به روش جامد، ضايعات کشاورزي به عنوان بهترين سوبسترا مطرح هستند. از سوبستراهاي مختلفي براي کشت ميکروارگانيسم ها جهت توليد آنزيم به کار گرفته شده اند. بعضي از سوبستراها شامل تفاله نيشکر، کاه گندم، کاه برنج، پوست ذرت، پوست گندم، پوست برنج، پوست نخود، سبوس برنج، پوست سويا، ضايعات مو انگور، خاک اره، چوب ذرت، الياف نارگيل، ضايعات چاي، تفاله نيشکر چغندر، روغن کيک نارگيل، آرد گندم، آرد ذرت و ….هستند. انتخاب سوبسترا براي توليد آنزيم در فرايند تخمير در بستر جامد وابسته به فاکتورهاي متعدداز قبيل قيمت و قابليت دسترسي سوبسترا است.[25]
در فرايند تخمير در بستر جامد،سوبسترا جامد نه تنها به عنوان ماده غذايي براي رشد ميکروب است بلکه به عنوان جايگاهي براي اتصال سلول است.سوبسترايي که تمام نياز هاي غذايي مورد نياز ميکروارگانيسم ها را براي رشد فراهم ميکند به عنوان سوبستراي ايده ال مطرح مي شود[25]
معمولأ ذرات کوچک سوبسترا سطح وسيعي را براي حمله ميکروبي فراهم مي کنند. کوچکي بيش از حد ذرات سوبسترا احتمال تراکم ميکروبي را زياد مي کند که خود مانع ازتنفس ميکروب ها يا هوادهي شده و نتيجه آن کاهش رشد است.[25]
اکثر روش هاي تخمير در بستر جامد،فرايند هاي ناپيوسته هستند اگرچه تلاش هايي در جهت ارتقاء آنها به سيستم هاي نيمه پيوسته وپيوسته صورت گرفته است.برخي از فرايندها نيازي به بيورآکتور ندارند و از طريق بخش بستربر محيط مناسب صورت ميگيرد.فرآيندهايي که براي آنها از ظروف تخمير استفاذه مي شود،نوسانات زيادي دارند[24]
فصل دوم:
ادبيات و سوابق تحقيق
2-1- مروري بر پيشينه تحقيق
در رابطه با جداسازي باکتري هاي مولد آنزيم ال آسپارژيناز در ايران پژوهشي براي جداسازي باکتري هاي هالوفيل مولد ال آسپارژيناز از درياچه مهارلو توسط ابراهيمي نژاد و همکاران( 2011) صورت گرفته است.

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

در پژوهش صورت گرفته که براي سنجش تاثير شرايط هالوفيليک انجام شده است مشخص گرديد که Bacillus sp. BCCS 034 بالاترين ميزان توليد آنزيم خارج سلولي IU/ml) 64/1 (را داشته است[24].
Ceder درسال 1968 گزارش داد که ال آسپارژيناز با يک سرعت ثابت به وسيله E.coli تحت شرايط بي هوازي سنتز مي شود[27].
در مورد شناسايي و جداسازي باکتري هاي مولد ال آسپارژيناز پژوهشي توسط Audipudi و همکاران در هند( 2013) انجام شده است که در آن باکتري هاي مولد ال آسپارژيناز از خاک هاي مانگرويي جداسازي و شناسايي شده اند. اين باکتري ها بيشتر متعلق به جنس باسيلوس و سودوموناس بوده اند [28].
پژوهشي با هدف جداسازي ميکروارگانيسم هاي مولد ال آسپارژيناز از گياه Ocimum sanctum. L توسط Karnataka (2010) صورت گرفته است. در اين تحقيق تمامي ميکروارگانيسم هاي جداسازي شده قادر به رشد در محيط حاوي آسپارژين به عنوان منبع نيتروژن بودند [29].
Yasser در سال 2002 بر روي توليد ال آسپارژيناز به وسيله Pseudomonas aeruginosa بر روي محيط کشت جامد کار کرد و همچنين بر روي تکامل و بهينه سازي محيط کشت با تاثير فاکتورهاي مختلف تحقيق کرد[30].
در تحقيق ديگري که در رابطه با جداسازي باکتري هاي مولد ال آسپارژيناز توسط Kambleو همکاران( 2012)از خاک نمکي و آب صورت گرفته است محيط کشت خاصي براي جداسازي اين باکتري ها طراحي شده و بيشتر ايزوله ها مربوط به جنس Serratia ، Basilus،Aeromonas Proteus بوده اند. E.coliو Pseudomonas aeroginosa نيز در ميان اين ايزوله ها وجود داشته است [18].
. Younes Ghasemi در سال (2008) بر روي تغليظ اجزاي اصلاح شده محيط کشت مختلف و منابع کربن مختلف که براي بهينه کردن محيط کشت استفاده شده تحقيق نموده وهمچنين بر روي جداسازي ال آسپارژيناز در E.coli مطالعه کرده است [31].
در پژوهش صورت گرفته توسط Bashaدر سال 2009 Actinomycete ها براي سنجش فعاليت آنزيمي غربال گري شدند.[32].
جداسازي ال آسپارژيناز از منابع باکتريايي پژوهش ديگري است که توسط Kushwaha و همکاران(2012) صورت گرفته است. در اين پژوهش تشکيل رنگ قرمز اطراف کلني ها به منزله توليد ال آسپارژيناز است. در اين پژوهش تخمير به حالت shake flask انجام شده است. توليد آنزيم با بررسي تاثير pH و ممانعت کننده ها و محرک ها مورد ارزيابي قرار گرفته است. pH بين 7-9 ودماي 37-50 درجه سانتي گراد بالاترين ميزان توليد آنزيم را داشته اند [33].
در زمينه جداسازي باکتري هاي مولد ال آسپارژيناز از خاک در هند Padhyay و همکاران( 2012) با استفاده از محيط کشت اصلاح شده M9 باکتري هاي مولد ال آسپارژيناز را با بهره گيري از حالت تخمير غوطه ور جداسازي کرده اند. در اين پژوهش 5 باکتري با فعاليت بالاي آنزيمي شناسايي شده است. [34]


پاسخی بگذارید